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Die Ursache der Resistenzdurchbrechung am milzbrand-infizierten Warmwasserfrosch

Die Ursache der Resistenzdurchbrechung am milzbrand-infizierten Warmwasserfrosch (Aus dom Hygienischen Instilul der Universität Zürich.) D ie U r s a c h e d e r R e s is te n z d u r c h b r e c liu n g a m m ilz b r a n d - in f iz ie r te n W a r m w a s s e r f r o s c h 1 . Von ZYGMUNT TESARZ. I. Einleitung. R. Koch (1) wies in seiner ersten, aus dem Jahre 1876 stam­ menden Arbeit über die «Bakteriologie der Milzbrandkrankheit» darauf hin, daß es ihm nicht gelungen sei, Frösche durch Impfung mit größeren Stücken Milz von an Milzbrand gestorbenen Mäusen zur Erkrankung zu bringen. Sechs Jahre später aber hat Gibier (2) gezeigt, daß die Resistenz des Frosches gegen Milzbrand durch Steigerung der Temperatur durchbrochen werden kann. Von 20 mit Milzbrand infizierten und bei 35—37° C gehaltenen Frö­ schen verendeten 5 mit Zeichen der Milzbrandsepsis. Gibier hat diesen fü r weitere Untersuchungen grundlegenden Versuch auf Anregung von Pasteur (3) ausgeführt, der zu dieser Zeit den Ein­ fluß der Temperatur auf die Resistenz studierte. Zusammen mit Joubert und Chamberland sah er die Ursache der Resistenz der Vögel gegen Milzbrand in der hohen Temperatur ihres Blutes und suchte seine Theorie dadurch zu beweisen, daß er Hühner durch Eintauchen in kaltes Wasser und permanente Abkühlung milz­ brandempfänglich machte. Der Gibiersche Warmwasser-Frosch­ versuch war also nichts anderes als die Wiederholung des H ühner­ experimentes mit umgekehrten Vorzeichen. Die Beobachtungen von Gibier fanden in der wissenschaft­ lichen Welt bis zu Metschnikoff (4) wenig Echo. Er aber baute seine Phagocytose- und zelluläre Immimitätslehre unter anderem auf Froschversuchen mit Milzbrand auf. Eine Wiederholung des Versuches von Gibier zeitigte ungefähr das gleiche Resultat. Von 15 mit tierischem Material infizierten und bei 38° C gehaltenen Fröschen starben im Verlaufe von 1 bis 3 Tagen 6 an Milzbrand. Freilich gingen — wie Gibier ebenfalls bereits beobachtet hatte — die Kontrollfrösche fast zu gleicher Zeit zugrunde. 1 Die Publikation erfolgte mit Unterstützung des Fonds für Nationale Kultur (Fundusz Kultury Narodowej). Eingegangen am 12. März 1940. Te s ar z, Die Ursache der Resistenzdurchbrechung . . . F ü r das Empfänglichwerden des warmen Frosches für Milz­ brand machte Metschnikoff die Ausscheidung von Leukozidinen und die in ihrem Gefolge eintretende Sistierung der Phagocytose verantwortlich. Da die Phagocytoselehre damals im Zentrum der Imunitätsforschung stand, ist es nicht erstaunlich, daß sich sehr zahlreiche Forscher (Lubarsch, 5; Heß, 6; Nuttal, 7; Petruschky, 8; Fahrcnholtz, 9; Voswinkcl, 10; Fischei, 11; Rohrschneider, 12; Sanarelli, 13; Klein und Coxwell, 14; Terni, 15; Dieudonné, 16; Ditthorn, 17; Preisz, 18; Galli-Valerio und Vourloud, 19; Kodanut, 20) um die Jahrhundertwende herum des Froschmilzbrandes an- nahmen. Wir verzichten darauf, alle die sich oft widersprechen­ den Ergebnisse der obengenannten Forscher anzuführen, und be­ schränken uns auf die Wiedergabe der in diesem Zusammenhang geäußerten grundsätzlichen Gedanken. Während Metschnikoff die Erklärung der Milzbrandresistenz des Frosches ausschließlich in der Phagocytose gesucht halte, haben andere Autoren gezeigt, daß die Milzbrandbazillen im Froschleibe auch extrazellulär zugrunde gehen. Petruschkij, Fah- renholtz und später Preisz sprachen den Froschleukocyten sogar jegliche Bedeutung für die Destruktion der Milzbrandbazillen ab und meinten, die Leukocyten dienten nur der Beseitigung toter Bazillen und deren Fragmente. Voswinkel berichtet, daß bei Zim­ mertemperatur gehaltene leukocytenarme Frösche (sog. «Koch- salzfröschc») die eingeführten Milzbrandbazillen in 6 Tagen voll­ ständig vernichten. Sanarelli schreibt: «Die Froschlymphe übt auf Milzbrandbazillen eine deutliche degenerative Wirkung aus, un­ abhängig von jedem Einfluß der Leukocyten.» Galli-Valerio und Vourloud sahen das Wesen der Resistenz der Kaltblüter in zwei Faktoren: «Les phagocytes et le pouvoir bactériolytique des h u ­ meurs.» Sehr aufschlußreich sind die Untersuchungen von Ko- dama aus dem Jahre 1913, womit das Thema der Milzbrandresi­ stenz des Frosches aufgehört hatte, die Mikrobiologen zu inter­ essieren. Dem Serum und dem «Ascites» des Frosches kommt nach Kodama keine bakterizide Wirkung zu. Dagegen hat das Serum die Eigentümlichkeit, die Vermehrung und die Kapselbil­ dung der Milzbrandbazillen zu hemmen. Außerdem ist die niedrige Körpertemperatur des unter normalen Verhältnissen lebenden Fro­ sches der Vermehrung der Milzbrandbazillen nicht zuträglich. Als wichtigsten Abwehrmechanismus bezeichnet Kodama wiederum die Phagocytose. Wenn man kapselhaltige Milzbrandbazillen Zim- mertemperatnrfröschen einimpft, so verschwinden zunächst die 5* Te s a rz , Die Ursache der Kesislcnzdurchbrechung Kapseln, worauf sie von den Leukocyten allmählich phagocytiert werden. Die Langsamkeit der vollständigen Vernichtung der Milz­ brandkeime im Froschkörper ist jedoch auffallend. Nuttal und gleichzeitig Petnischkij haben l(i bzw. 20 Tage nach der Impfung noch virulente Milzbrandkeime im Froschkörper feslgestellt. Ditt- horn gelang es durch Zufall, noch 3 Monate nach der Impfung im Rückenlymphsack lebende Milzbrandbazillen zu finden, die sich für Mäuse fast voll virulent erwiesen. Derselbe Autor hat auch eindeutig bewiesen, daß die Milzbrandbazillen im Frosch­ körper nicht an Virulenz verlieren. Titrationen an Mäusen zeigten im Gegenteil, daß die Virulenz nach 20 Froschpassagen zugenom­ men hatte. Die Untersuchungen über die Ursache der Resistenzdurch- brecluing, von Gibier und Metschnikoff inauguriert, gingen eigent­ lich mehr nebenher. Nuttal stellte Versuche mit Fröschen bei verschiedenen Temperaturen an. Bei 23° C beobachtete er, im Gegensatz zu den Versuchen bei niederer Temperatur, eine starke Vermehrung der Bazillen, gleichzeitig schien aber auch die Tätig­ keit der Leukocyten gesteigert zu sein, denn die Milzbrandbazillen gingen trotz anfänglicher Vermehrung schneller zugrunde als in kalten Fröschen. Bei 25—30° C starben die Frösche innerhalb 23—42 Std. mit spärlichen Zeichen von Milzbrand. Die Kontroll- frösche gingen in fast ebenso kurzer Zeit zugrunde. Bei 30—37° C vermehrten sich die Milzbrandbazillen üppig. Alle Tiere starben innert 14 Std. Die Phagocytose war ganz geringgradig. Die Resi­ stenzdurchbrechung betrachtet Nuttal als Folge der mit höherer Temperatur einhergehenden Herabsetzung der Lebensenergie der Frösche. Der widerstandslos gemachte Körper wird, wie der von nach dem Tode infizierten Fröschen, von den Milzbrandbazillen ungehemmt durchwachsen. Ähnlicher Ansicht waren auch Lu- barsch und Sanarelli, die von einer durch die Temperaturerhöhung ausgelösten Schädigung des Gesamtstoffwechsels sprechen. Pe- truschky führte das Angehen der Milzbranderkrankung bei den zwischen 25—30° C gehaltenen Fröschen auf die tem peratur­ bedingte größere Wachstumsenergie der Bazillen und die Vermin­ derung der Kohlensäurespanmmg im warmen Frosch zurück, wo­ bei er sich auf Ergebnisse von Frankel (21), Pasteur und Joubert - sowie Szpilmann 3 stützte, die eine schädigende Wirkung der Koh- * 3 5 Zitiert nach Frankel (21). 3 Zitiert nach Frankel (211. am milzlirnmlinfiziorten VVnrmwasserfrosch 53 lensäure auf die Milzbrandbazillen festgestellt hatten. Eigene experimentelle Beweise für diese Hypothese zu erbringen gelang Petruschky nicht. Fahrenholz meint, die Milzbrandresistenz des kalten Frosches sei durch die relativ niedrige Temperatur und die «Ungunst des Nährbodens» bedingt, was durch die Temperatur­ erhöhung beseitigt werden sollte. Nach Rohrschneider bildet eine Temperatur von 28° C die untere Grenze, bei der eine Entwick­ lung der Milzbrandbazillen im Froschkörper erfolgen kann. Ober­ halb 28° C gehen sämtliche infizierten Frösche an Milzbrand zu­ grunde. Durch Fütterung konnte Rohrschneider auch bei warmen Fröschen keine Milzbrandinfektion auslösen. Dieudonné führte die Milzbrandresistenz des Frosches teilweise darauf zurück, daß die eingeimpften Bazillen l>ei der Temperatur des normalen Fro­ sches nicht zur Entwicklung gelangen. Gestützt wurde diese Auf­ fassung durch die Beobachtung, daß ein während längerer Zeit bei 12° C gezüchteter Milzbrandstamm nunmehr üppig wuchs und dann auch die kalten Frösche zu infizieren vermochte. Dar­ aus zog Dieudonné den Schluß, daß die Ahwehrkräfte des Frosch­ organismus nicht besonders entwickelt sind, reichen sie doch nicht weiter, als um der durch das plötzliche Überpflanzen in völlig veränderte Bedingungen an und für sich schon sehr geschwächten Bakterien Herr zu werden, während die vorher wenigstens an die Temperatur angepaßten Bazillen ihnen erfolgreichen Widerstand leisten. Die von Dieudonné mit dem «Kaltstamm» erzielten Ergeb­ nisse wurden neuerdings durch Lederer (22) bestätigt, der mit einem längere Zeit bei 10— 12° C gezüchteten Milzbrandstamm auch kalte Frösche regelmäßig erfolgreich zu infizieren vermochte, womit die älteren Untersuchungen von Galli-Valerio und Vour- loud, die einen Milzbrandstamm wochenlang bei Zimmertempera­ tur (18—20" C) züchteten, ohne damit dessen Pathogenität für die kalten Frösche erreichen zu können, widerlegt worden sind. Aus dieser die wesentlichen Daten berücksichtigenden, histori­ schen Übersicht geht jedenfalls hervor, daß das Problem der Resi- stenzdurchbreclnmg im milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch bisher nicht gelöst worden ist. Die Interpretationen, die die Auto­ ren ihren Versuchsresultaten gaben, bleiben meistens reichlich spekulativ, die Versuchsergebnisse selbst häufig widerspruchsvoll. Dies und die grundsätzliche Bedeutung, welche der Resistenz und ihrer Durchbrechung zukommen, veranlaßten uns, dieses alte Pro­ blem erneut zu bearbeiten und dabei Methoden heranzuziehen, die von der üblichen immunisatorischen Betrachtungsweise abwei- T e s a r z , Die Ursache der Resislenzdurchbrcchung dien. Dazu bewegte uns die bereits alte Erkenntnis, daß die Phä­ nomene der Phagocytose und der Säftebakterizidie liei weitem nicht für die vollständige Erklärung der Milzbrandresistenz aus­ reichen. Zwischen der Resistenz einer Tierart und der anthrako- ziden Wirkung ihres Blutserums und der Phagocyten in vitro be­ steht kein Parallelismus. Wenn sich vielleicht auch viele Wider­ sprüche älterer Versuche durch die mangelnde Berücksichtigung der Kapsel verstehen lassen, so bleibt es doch nach wie vor unver­ ständlich, daß das Blutserum einer hochempfänglichen Tierart, wie z. B. der Kaninchen, in vitro Milzbrandbazillen sehr energisch abtötet, während andererseits das Hunde- und Hühnerserum, also das Serum zweier refraktärer Tierarten, so gut wie jeder bakteri­ ziden Wirkung ermangelt. Es scheint also, daß die Resistenz ein komplizierteres Phänomen darstellt, bei dem nebst Phagocytose und Bakterizidie noch andere, zurzeit wohl noch unbekannte Faktoren eine Rolle spielen müssen. Nichts berechtigt uns zur Annahme, daß cs bei den Kaltblütern bzw. bei den Fröschen anders sein sollte. Die immunologischen Phänomene der Kalt­ blüter unterscheiden sich prinizipiell nicht von denen der W arm ­ blüter. Schwarzmonn (23) wie auch Ehert (24) haben die Bildung von Agglutininen und Präzipitinen im Frosche nachgewiesen. Man kann Frösche auch anaphylaktisch machen und die Anaphylaxie passiv übertragen (Friede und Ehert, 25; Friede, Messik, Schachun- janz, 26). Die Erhöhung der Temperatur übt einen günstigen Einfluß auf die Antikörperbildung aus (W idal und Sicard*, Ehert). Da also die humoralen Immunitätserscheinungen im Froschorganismus grundsätzlich mit denjenigen des Warmblüters übereinstimmen, können wir von ihnen ebensowenig eine vollstän­ dige Erklärung der Milzbrandresistenz des Frosches erhoffen, als wir das gegenüber andern Erregern im Bereich der Warmblüter vermögen. Aus diesem Grund haben wir von vornherein auf die Unter­ suchung von Phagocytose und Bakterizidie beim Frosch verzich­ tet und unser Augenmerk auf das Vorhandensein weiterer F ak­ toren gerichtet. Dabei griffen wir gewissermaßen auf die alle, durch Baumgarten und Petruschky vertretene Assimilationstheo­ rie zurück, die das Gewebe der refraktären Tierarten als ungün­ stigen Nährboden für entsprechende Bazillen ansahen. Jeder • Zitiert nach /?. Paltauf, Agglutination, Hdb. ct. Mikroorg. (Kolle und Wassermann), Bd. II, T. 2, Aufl. 111, 1924. Berlin. am milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch Nährboden beeinflußt die Lebensform und das Wachstum der Bakterien über seine chemischen wie auch physikalischen Eigen­ schaften. W ir haben uns die Frage gestellt, ob die Resistenz­ durchbrechung nicht eine Folge der unter dem Einfluß der Tem­ peratur stattfindenden Veränderung der physikalischen Eigen­ schaften des Froschgewebes sein könnte. Unter den theoretisch mehreren Möglichkeiten haben wir zwei untersucht: 1. Die Wasserstoffionenkonzentration; 2. Die Sauerstoffspannung des Froschblutes bzw. -gewebes. II. Vorversuche über die Beeinflussung der Milzbrandresistenz durch die Temperatur. In allen Experimenten verwendeten wir R. temporaria. Die Frösche w ur­ den vor dem Versucli im Bassin mit fließendem Wasser (12—14° C) gehalten und zwangsmäßig mit Larven von Tenebrio motitor, Meersclnveinchenlebcr oder frei mit Calliphora vomitoria g efüttert6. Für die Versuche wurden die Tiere in Standgläsern mit Wasser gehalten, die mittels elektrischer Tauch­ körper auf die gewünschte Temperatur gebracht wurden. Thermoelektrische Bestimmungen in der Kloake der Frösche zeigten, daß die Temperatur der Tiere 0,5— 1,0° C niedriger war als die Temperatur des Wassers. Die Ver- suchstemperaturen betrugen mehrheitlich 15, 25 und 30° C, einzelne Tiere w ur­ den auch bei 5 und 35° (', gehalten. 25° C waren ohne Einfluß auf die Lebens­ dauer der Frösche, bei 30° C lebten sie nur 2—4 Tage. Zur Infektion verwen­ deten wir einen am Meerschweinchen geprüften Stamm mittlerer Virulenz. Die Infektion erfolgte über den dorsalen Lymphsack, von einer 24 Std. alten Milzbrandkultur ausgehend. Keiner der bei 15 und 25° C gehaltenen Frösche ging an der Infektion zugrunde. Die bei 30° C gehaltenen Tiere gingen nach der Injektion von 30— 40 Millionen Keimen regelmäßig an einer bakteriosko- pisch und kulturell kontrollierten Milzhrandsepsis ein. Die entsprechenden KontroUliere überlebten die infizierten um 12—48 Std, Bei Verwendung klei­ nerer Milzbranddosen kam es vor, daß die Tiere vor Entwicklung des septi­ schen Krankheitsbildes den Wärmetod erlitten. Die Bazillen der verendeten Tiere waren mehrheitlich von Kapseln umgeben, büßten ihre Virulenz für den Warmblüterorganismus nicht ein und wurden für Kaltfrösche nicht pathogen. Ein von uns herausgezüchteter «Kaltstamm» büßte während der Züchtung seine Virulenz für die Warmblüter ein, blieb aber vollkommen apalhogen für die Kallfrösche. 111. Beeinflussung des Blut-pH durch die Temperatur. Diese Arbeitshypothese stützte sich auf die in der Literatur wiederholt anzutreffende Anschauung, daß die Serumbakterizidie durch die Blutalkalität gesteigert werde (v.Fodor. 27; v. Bigler, 1 1 für deren Überlassung wir Herrn Dr. Wiesmann von der J. R. Geigy AG., Basel, zu Dank verpflichtet sind. Te s ar z, Die Ursache der Resistenzdurchbrechung 28; Behring, 29; Gruber und Futaki, 30, u. v. a.). Nach Gräber und Futaki hat die Verminderung der Blutalkalität eine verrin­ gerte Absonderung von Anthrakozidin seitens der Zellelemente zur Folge. Behring bezog die Resistenz der weißen Ratten gegen Milzbrand auf die Tatsache, daß das Rattenblutserum eine be­ trächtlichere Alkalcszenz als das Serum empfänglicher Tiere auf­ weist. v. Fodor und v. Bigler haben in ihren Untersuchungen die milzbrandfeindliche Auswirkung der Blutalkalität in vitro wie auch in vivo bewiesen. Die Möglichkeit, in dieser Richtung weiter­ zukommen, wurde noch durch die Arbeit von Austin, Sunder­ mann und Camack (31) gestützt. Sie haben den Serum-pH von Alligatoren, die bei niedriger und hoher Temperatur gehalten wur­ den, colorimetrisch gemessen und folgende Werte gefunden: Serum-pH bei 9” C 7,72, bei 35° C 7,27. Die Literaturangaben über den pH der Säfte der Frösche sind sehr spärlich. Rohde (32) hat mit einer später als unzuläng­ lich erkannten Methode fü r das Blut von R. esculenta pH-Werte im Bereich von 0,32 bis 7,12 gefunden. Nach Fütterung mit Borax­ säure sanken sie auf pH = 4,2, nach Fütterung mit Natriumkar­ bonat stiegen sie auf pH = 8,7. Barkan, Broemser und Hahn 0 geben für das arterielle Froschblut pH = 7,68. für das venöse pH = 7,51 an. Nach Winterstein (33) bewirkt bei Fröschen die Steigerung der Temperatur ein Sinken des pH im Blute, wogegen Evans gerade das Umgekehrte angibt und fü r 20° C Temperatur­ zunahme einen pH-Anstieg von + 0 ,2 feststellt. Unsere pH-Messungen wurden mit einem Apparat, der nach dem Prinzip der Glaselektrode von Michaelis und des Verstärkungspotentiometers nach Young arbeitet, durchgeführt* 7. Seine Fehlergrenze beträgt ±0,02. Die Frösche wurden 48 Sld. vor dem Versuch bei gewünschter Temperatur gehalten. Die Blutgewinnung unter Luftabschluß stieß anfänglich auf nicht unerheb­ liche Schwierigkeiten, die verständlich werden, wenn man bedenkt, daß unsere Frösche 30—40 g schwer waren und sich das Verhältnis Blut—Körpergewicht innerhalb der Werte I : 20—1 : 15,3 (Welcher *) bewegt. Nach langen Vorver­ suchen haben wir schließlich eine Technik gefunden, die uns jederzeit die Ge­ winnung von 0.5— 1,0 ccm Froschblut unter Luftabschluß ermöglichte. Das Versuchstier wird narkotisiert («Numal» 0,1—0,2 ccm subc.) und fixiert. Mit­ tels eines Thermokauters (Vermeidung des Blutverlustes) eröffnet man die Leibeshöhle, entfernt das Perikard, faßt das schlagende Herz mit einer speziell konstruierten zweilöffligen Pinzette und sticht in die Kammer eine fein aus­ “ Zitiert nach Winlerstein (33). 7 Herrn Prof. Ilossier sei auch an dieser Stelle für das Interesse, das er der Arbeit entgegenbrachte, seine mannigfaltigen Ratschläge und die Überlas­ sung der Apparaturen verbindlichst gedankt. am milzbrandinfizierten Wanmvasserfroscli gezogene, im Innern paraffinicrle, in ihrem Spitzenteil mit Paraffinum liqui­ dum gefüllte Pipette ein. Das Blut wird durch Herzkontraktionen in die hori­ zontal gehaltene Pipette eingepumpt und durch das flüssige Paraffin vor der Berührung mit der Luft (COj-Spannung) geschützt. Nach der Herzpunktion wird das gewonnene Blut sofort in einem Reagensglas flüssigem Paraffin unterschichtel und gründlich mit einem gerinnungshemmenden Pulver (0,002 g Natriumfluorat + 0,001 g Kaliumoxalat auf 1 ccm Blut) vermischt. Der ganze Eingriff wurde in einem Raum vorgenommen, dessen Lufttemperatur derjeni­ gen des Wassers des Versuchsfrosches entsprach. Die pH-Messung erfolgte nicht später als 2 Std. nach der Blutentnahme. Tabelle 1 orientiert über die pH-Werte des den bei den verschiedenen Temperaturen gehaltenen Fröschen entnommenen Blutes. TABELLE I. pH-Werte des Froschblutes. Nr. 0 ° c pH-Werte mildere Werte 1 5° 7.12 7,18 2 7.12 3 7.2a 4 7.22 5 7,14 15° 7,21 6 7.15 7 7.24 8 7,32 7,18 10 30'1 7,26 7,31 11 7,32 7,24 13 7,31 Aus den in Tabelle I wiedergegebenen Daten, die sich in der Richtung der von Evans gefundenen bewegen, ergibt sich die voll­ kommene Haltlosigkeit unserer ersten Arbeitshypothese. Das pH des Froschblutes kann bei der Durchbrechung der Milzbrand­ resistenz im warmen Frosch keine Rolle spielen, weil die parallel mit der Steigerung der Temperatur gehende Erhöhung der Blut­ alkalität nach übereinstimmenden Angaben die Serumbakterizidie nicht vermindert, sondern steigert. VI. Einfluß der Temperatur auf die Oo-Spannung im Gewebe. Unsere zweite Hypothese läßt sich folgendermaßen form u­ lieren: Ist die Milzbrandresistenzdurchbrechung im warmen Frosch ganz oder teilweise durch eine allfällige Erhöhung der Oa- Spannung im Froschgewebe zu erklären? T e s a r z , Die Ursache der Resistenzdurchbrechung Diese Hypothese basiert auf folgenden Vorstellungen. Der Milzbrandbazillus entwickelt sich optimal — wenn auch fakultativ anaerob wachsend — nur bei ungehindertem Luftzutritt. Die Oj- Spannung des Nährbodens hzw. des Froschgewebes muß daher einen bedeutenden Einfluß auf seine Wachstumsenergie ausüben. Der kalte Frosch hat einen sehr langsamen Stoffwechsel. Die Os-Spannung im Gewebe ist dementsprechend wahrscheinlich sehr gering und wohl nicht genügend für eine optimale Entwicklung des Milzbrandbazillus. Die Erhöhung der Temperatur bewirkt nun auch beim Frosch eine, quantitativ der van Hoff sehen Regel entsprechende (Qm0 — 2—3), Steigerung des Stoffwechsels. Der daraus resultierende größere Bedarf des Gewebes an O? kann nur dann gedeckt werden, wenn die Os-Spannung im Gewebe parallel dem Stoffwechsel ansteigt. Dadurch werden aber auch die Wachs­ tumsbedingungen fü r den Milzbrandbazillus wenigstens punkto Os verbessert. Die Erhöhung der Os-Spannung im Gewebe des warmen Frosches könnte deshalb wenigstens teilweise (im Sinne eines das Wachstum des Milzbrandbazillus fördernden Faktors) dazu beitragen, die Milzbrandresistenz des Frosches oberhalb 28° C zu brechen. Wenn auch die experimentelle Bearbeitung dieser Frage­ stellung wegen Mangels an diesbezüglichen Literaturangaben und wegen zurzeit unlösbarer technischer Schwierigkeiten nicht rest­ los befriedigend durchgeführt werden konnte, so fanden wir — wie zu zeigen sein wird — doch zahlreiche Anhaltspunkte, die zugunsten unserer Arbeitshypothese sprechen. Ein erster Versuch der Beweisführung galt der Verfolgung der Vermehrungskurve des Milzbrandbazillus bei verschiedenen Os-Spannungen in vitro. a) Abhängigkeit der Wachstumspotenz des Milzbrandbazillus von der Oi-Spannung in vitro. Diese Unlersuchungsreihe wurde mit dem gleichen Milzhrandslamm durchgeführt, den wir für Infektionsversuche verwendeten. Abgemessene Bouillonmengen wurden mit verschiedenen Mengen der .Milzbrandbazillen (30—500 000) einer 24 Std. allen Bouillonkultur beimpft. Die Reagcnsröhr- chen wurden mit einem Gummizapfen verschlossen, der von einem dünnen Glasröhrchen perforiert war. Das Glasröhrchen wurde an eine Vacuumöl- pumpc angeschlosscn und nach Erstellung des gewünschten Druckes zuge- schmolzen. Um eine Vermehrung der .Milzbrandbazillen während der Zeit des Druckausgleichs zwischen Bouillon und Luftraum zu verhüten, wurden die Röhrchen vorgängig der Bebrütung für 4—6 Std. bei 15° C gehalten. Um den am milzbrandinfizierten Warmwasserfrösch Einfluß der 0 2-Zchrung durch die wachsende Kultur in den gasdicht ab­ geschlossenen Bouillonröhrchen möglichst auszuschallen, sorgten wir für gro­ ßen Luftraum über der Bouillon und bebrüteten die Kulturen nur 8 bis maximal 24 Std. Die Keimzählung führten wir bei jeder Untersuchungsreihe mittels der Plattenmethode doppelt aus. Tabelle II gibt Auskunft über die gewonnenen Resultate. Die Keimzahlen sind in prozentualen Werten aus­ gedrückt; 100% entsprechen der Keimzahl bei freiem Luftzutritt. TABELLE II. Wachstum des Milzbrandbazillus in verschiedener Oj-Spannung. 0 2-Spannung im Rgl. mm Hg 20 10 6 4 2 I I. Reihe — — 10,0 3.2 0,4 0,8 II. Reihe — 31,7 8,3 3,4 1,5 — — 111. Reihe 30,0 10,0 1,7 1,1 IV. Reihe 25,0 8,0 9,0 1,7 0,2 0,1 V. Reihe 70,5 23.8 3,3 1,5 0,3 57,1 VI. Reihe 33,3 13,3 7,5 0,7 0,3 0,1 VII. Reihe 38,0 20,0 11,3 4,0 2,0 1.3 VIII. Reihe 23,8 11,9 8,1 1,9 0,5 0,3 Mittlere Prozcntzahlen 38,1 26,3 16,4 4,1 1,3 0.6 Verhäitniszahlen 1 L5 2,3 9 29 63 Die in der Tabelle angeführten Zahlen zeigen, daß die Ver- mehrungsgesehwindigkeit des Milzbrandbazillus mit sinkender Oi- Spannung tatsächlich abnimmt. Bezeichnen wir sie hei 20 mm Hg mit 1, so ist sie bei 10 mm 1 A mal, bei 6 mm 2,3mal, bei 4 mm 9mal, bei 2 mm 29mal, bei 1 mm Hg 63mal kleiner. Anders aus­ gedrückt, ist die Vermehrungsintensität hei einer Ös-Spannung von 4 mm Hg 7mal, bei 6 mm Hg 27mal, bei 10 mm Hg 42mal, bei 20 mm Hg 63mal so groß wie bei 1 mm Hg. Diese Unterschiede lassen klar erkennen, daß der Einfluß der CD-Spannung auf die Vermehrungsintensität des Milzbrandbazillus relativ groß und un­ sere Hypothese vom Standpunkt der Biologie des Mikroorganismus aus gerechtfertigt ist. Dabei sei erwähnt, daß der durch die Bruttemperatur bedingte Wachstumsunterschied des Milzbrandbazillus bei 25° C (Überleben des Frosches) und bei 30° C (Milzbrandsepsis) als bescheiden an­ zusprechen ist, beträgt er doch nur das 2 A fache (siehe Tabelle VII). Die Analyse der gefundenen Werte gibt uns aber auch Aus­ kunft über das Maß der graduellen Empfindlichkeit des Milz­ brandbazillus für eine Ch-Reduktion. Das läßt sich am besten aus T e s a r z , Die Ursache der Kcsistcnzdurchbrechnng einer graphischen Darstellung (Tabelle III) erkennen. Die Steilheit der Kurve lehrt uns, daß die Empfindlichkeit des Milzbrandbazil­ lus auf die Os-Reduktion bei den absolut kleinen Werten am größten ist, was mit Rücksicht auf die ebenfalls absolut kleinen Werte der Ch-Spannung, mit denen im Froschgewebe zu rech­ nen ist, von erheblicher Bedeutung sein dürfte. Der nächste Schritt in der Beweisführung drängte sich von selbst auf. Jetzt galt es, die Os-Spannung im Gewebe des kalten und des warmen Frosches zu messen und die gewonnenen Resultate mit den Ergebnissen der in vitro durchgeführten Untersuchungen zu vergleichen. Damit wäre der direkte Beweis für das Ausmaß Tab. III. Vermehrungskurve des Milzbrandbazillus. der Richtigkeit unserer Hypothese erbracht. Leider sahen wir uns aus Mangel einer zuverlässigen Methodik und zufolge unüberwind­ licher technischer Schwierigkeiten gezwungen, auf diese direkte Beweisführung, d. h. auf die Messung der Oa-Spannung im Frosch­ gewebe, zu verzichten. Eine Zeitlang hofften wir, den in der Froschlymphe physikalisch gelösten Oa quantitativ bestimmen zu können. Die Ausbeute an Froschlymphe erwies sich aber als so gering, daß die absolut gesehenen minimalen Schwankungen des Oa-Gehaltes durch die methodischen Fehlergrenzen überdeckt werden. Es blieb somit nichts anderes übrig, als die Beweisfüh­ rung auf indirektem Weg zu suchen. Das setzt allerdings den meritorischen Wert unserer Arbeit herab, tritt doch an Stelle des eindeutigen Beweises nur ein mehr oder weniger großer Grad von Wahrscheinlichkeit. am milzbrandinfizicrlen Warmwasserfrosch «1 Der einzige gangbare Weg war die theoretische und experi­ mentelle Analyse des Ch-Transportproblems. W ir haben, und wie die Ergebnisse zeigen, wohl mit Recht, vermutet, daß sich daraus gewichtige Rückschlüsse auf die O2-Versorgung und -Spannung des Froschgewebes ergeben. Von besonderem Nutzen waren für uns dabei die Untersuchungen über das Verhalten des Hämoglo­ bins bei verschiedenen Temperaturen. b) Einfluß der Temperatur auf die Ch-Sättigung des Froschblutes. Schon im Jahre 1878 hatte Paul B e r t8 beobachtet, daß menschliches Blut bei Zimmertemperatur und 15 mm Hg O2- Druck zu 90%, bei Körpertemperatur dagegen nur zu 50% gesät­ tigt war. Barcroft und King (35) (1909) und besonders Brown und Hill (36) (1923) haben eingehende Untersuchungen an W arm ­ blüterhämoglobinlösungen durchgeführt und das Verhalten der Dissoziationskurven in Abhängigkeit von der Temperatur stu­ diert. Dabei hat sich gezeigt, daß die O-Dissoziationskurve mit Steigerung der Temperatur sinkt, verflacht, d. h. die Sättigung des Hämoglobins mit O2 kleiner wird. Hartridge und Roughton (37) haben mit einer sehr eleganten Methode die Geschwindig­ keitskonstanten der Reaktion Hb + O2 ^ HbOi direkt gemessen und haben dabei folgendes feslgeslellt: Die Geschwindigkeitskon­ stante (ki) der Oxydationsphase Hb + Oi — > ■ HbOa ist bedeutend größer als diejenige (k) der Reduktionsphase HbO? — > ■ Hb + O2 . Ihr Verhältnis, also die Gleiehgewichtskonstante (K) der Reaktion Hb -f- O2 ^ Hb02 drückt sich aus: = k 17,5 Weiterhin ist die Reduktionsphase HbOs— Hb -j- O2 im Gegen­ satz zur Oxydationsphase sehr empfindlich für die Bedingungen, unter denen sie stattfindet, und zwar bewirken Steigerungen der H'-Konzentration wie der Temperatur eine Zunahme der Ge­ schwindigkeitskonstante ki. Für eine verdünnte Schafshämoglo­ binlösung besitzt die letztere den hohen Temperaturkoeffizien­ ten 3,8. In gleicher Richtung bewegten sich auch die von Magela und SeliSkar (38) durchgeführten Untersuchungen über das Frosch­ hämoglobin. Sie haben Oa-Dissoziationskurven für Froschhämo- 8 8 Zitiert nach hrown und Hill (36). Te s ar z, Die Ursache der Hcsistcnzdurchbrechung «2 globin bei 15, 25 und 35° C aufgestellt und denselben Einfluß der Temperatur beobachtet. Der auf Grund von «tension of unload- ing» (Os-Druck, bei dem das Hämoglobin zu 50% Ch-gesättigt ist) errechnete Temperaturkoeffizient beträgt 2,5, ist also geringer als derjenige des menschlichen Hämoglobins (Qio = 5,6). Uns sind diese Befunde über die Kinetik des Oxyhämoglobins sehr zugute gekommen. Die Steigerung der Os-Spannung im Ge­ webe des warmen Frosches erfordert zwangsläufig einen größe­ ren Os-Druck im Blut, der seinerseits unter anderem eine größere Dissoziationsfähigkeit des Oxyhämoglobins, als sie im Gefolge einer Temperaturerhöhung tatsächlich zustande kommt, zur Vor­ aussetzung hat. Einem ähnlichen Gedankengang ist Rossier (39) gefolgt, als er die Erfrierungen auf eine Dissoziationshemmung des HbOa und anderer Redoxsysteme zurückführte und damit als Folge einer Anoxämie des Gewebes interpretierte. Lutz (40) und v. Wert (41) haben diesen Gedanken experimentell untermauert. Im Verlauf ihrer Untersuchungen über die Ursache des Kältetodes der W arm­ blüter stellten sie tatsächlich eine mit sinkender Temperatur ein­ hergehende Verminderung der Oxyhänioglobindissoziation fest, die ihrerseits zum Oa-Mangel im Gewebe führte. Der HbOa-Gehalt des Venenblutes der Versuchstiere (Katzen, Kaninchen) stieg bei der Abkühlung von 37° C auf 20° C durch­ schnittlich um 20%. Trotz dieser recht erheblichen Zunahme der Os-Sättigung sinkt nun aber der Os-Druck des Blutes auf so kata­ strophal niedrige Werte, daß sie schlußendlich zur Erstickung der Gewebe führen, welche schon den Beginn der Abkühlung mit er­ höhtem Stoffwechsel und damit gesteigertem Os-Bedarf beant­ worten. Die Kinetik des Oxyhämoglobins spielt also bei Lutz und v. Werz theoretisch und experimentell die gleiche Rolle wie bei uns, mit dem Unterschied, daß unsere Beweisführung die um­ gekehrte Richtung einschlägt. Um die Richtigkeit unserer An­ nahme nachzuweisen, stand uns nur die Möglichkeit offen, das Oxyhämoglobin im Blut des kalten und warmen Frosches zu be­ stimmen. Die Ergebnisse von Magela und Selisknr konnten nicht einfach übernommen werden, weil diese Autoren mit Hämoglo­ binlösungen und nicht mit Vollblut gearbeitet und den Einfluß der Temperatur auf das Froschhämoglobin in vitro und nicht in vivo studiert hatten. am milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch 63 F ür die Bestimmungen des H b 0 2-Gehaltes im Froschblut haben wir die gleiche Blutgewinnungsmethode angewandt wie für die pH-Messungen. Die einzige Modifikation bestand darin, daß wir dem Frosch vor der Eröffnung der Leibeshöhle 0,1 ccm Heparin in die Vena abdominalis injizierten. Wir vermieden dadurch die trotz Paraffinierung bisweilen auftretende Gerinnsel- bildung in der Punktionspipette. An die Blutentnahme wurde die Bestimmung der Oj-Sättigung und der ()»-Kapazität sofort angeschlossen, um die 0 2-Zeh- rung (Morawitz und Warburg haben gezeigt, daß kernhaltige Erythrocyten einen erheblichen 0 2-Verbrauch aufweisen) zu vermeiden. Wir benutzten das leicht abgeänderte Differcnlialmanomeler nach Ilaldane (42), stießen aber bei Befolgung seiner Technik auf zunächst unüberwindlich scheinende Schwierig­ keiten. Beim Durchschüttein mit 4%iger Na*C03-LöSung bildete das Frosch­ blut keine Klümpchen, und nach Zusatz von Ferricyanidlösung verwandelte cs sich in einen dicken Gelee, wodurch natürlich die Ciasbeslimmung verun­ möglicht wurde. Die gleiche Beobachtung wurde auch von andern For­ schern gemacht (für Froschblut von W eiß 0, Barcroft [43] u. a., für Fischblut von Krogh und Leitch [44]). Magela und Scliskar bestimmten das Oxyhämo­ globin im Froschblut mit einem «reversion spectroscope» nach Ilartridge. Da uns dieses Instrument nicht zur Verfügung stand, mußten wir einen andern Ausweg suchen. Nach langen, vergeblichen Bemühungen haben wir festgestellt, daß der stark alkalische pH (11,5—12,0) der oben genannten Lösungen die Geleebildung auslöstc. Wir ersetzten deshalb das Natriumkarbonat durch einen «Borat»-Salzsäure-Puffer vom pH = 9,0, dessen Eignung wir durch wieder­ holte Untersuchungen mit Menschenblut sicherstellten. Beim Durchschütleln mit dieser Pufferlösung blieb das Froschblut flüs­ sig und wurde nach Zusatz von Ferncyanid nicht dickflüssiger als normaler­ weise das Menschenblut. Die Zuverlässigkeit der Methode in Anwendung auf Tab. IV. Oxyhämoglobingehalt des Froschblutes. . = Rohwerle — entsprechende Wahrscheinlichkeitskurve X = korrigierte Werte — entsprechende Wahrscheinlichkeitskurve • Zitiert nach Barcroft (43). T e s a r z , Die Ursache der Resistenzdurchbrechung das Froschblut geht daraus hervor, daß Parallelunlersuchungen mit der van .S/yA'cschen Apparatur, die Herr Prof. Rossier für uns ausführte, Abweichun­ gen von nicht mehr als 2% ergaben. Tabelle IV orientiert über den Oxy- hämoglobingehalt des den bei den verschiedenen Temperaturen gehaltenen Fröschen entnommenen Blutes. Die Interpretation dieser Tabelle erfordert eine kurze Erläu­ terung. Mit der gasometrischen Methode nach Haldane-Barcroft bestimmt man bei jeder Blutprobe zwei Werte: die zu vollstän­ diger Sättigung fehlende O-Menge (B) und die gesamte Os-Kapa- zität (C). Daraus rechnet man die prozentuale Sättigung: r __ n A — C — B = 100 - — Weder die gebrauchte Blutmenge noch die Konstante des Apparates, noch die Korrektur für Barometerdruck und Tempera­ tur tritt in der Rechnung auf. Dagegen verlangen die beim Schüt­ teln des Blutes physikalisch in Lösung gehenden N und Cb eine Gaskorrektur, denn das physikalisch gelöste Gas, dessen Menge vom Partialdruck und der Temperatur des Gases abhängt, mit dem das Blut zuvor im Spannungsgleichgewicht stand, bedingt, daß der ermittelte Wert des an das Hb chemisch gebundenen 0= nicht dem effektiven Wert entspricht. Da die Bestimmungen der Os-Sättigung des Froschblutes durchwegs bei Zimmertemperatur (14— 16° C) vorgenommen wurden, muß die Gaskorrektur um so beträchtlicher sein, je mehr die Froschtemperatur von der Unler- suchungstemperatur abweicht. Als Adsorptionskoeffizienten der Gase bei verschiedenen Temperaturen nahmen wir Werte, wie sie für das menschliche Blutplasma bekannt sind. Die N-Korrektur ließ sich glatt errechnen, dagegen konnte die Cb-Korrektur nicht einwandfrei ermittelt werden. Es fehlte dazu eine wesentliche Unterlage, nämlich die Kenntnis des Cb-Partialdruckes im Frosch­ blut. Dieser kann nur an Hand der Cb-Dissoziationskurven des Froschgesamtblutes bei verschiedenen Temperaturen erhoben werden. Da solche bis jetzt nicht existieren und deren Aufstellung zu viel Zeit in Anspruch genommen hätte, haben wir den theore­ tischen Wert fü r Cb-Druck im Froschblut mit \% Ata angenom­ men (beim Menschen im venösen Blut pCb = 5—6 Ata). Dieser uns aufgezwungene Fehler in der Berechnung der Cb-Korrektur verändert aber das Ergebnis der Os-Sättigung um nicht mehr als 1%. Wenn deshalb die ausgezogene Kurve in Tabelle IV für die höheren Temperaturen sicher zu niedere Werte angibt, so verbin­ det die unterbrochene Linie wahrscheinlich etwas zu hohe Werte. am mUzbrandinfizierten Warmwasserfrosch Das ändert nichts an der prinzipiellen und aus der Tabelle leicht ersichtlichen Tatsache, daß die Oa-Sättigung des Frosch­ hämoglobins, gemessen im Herzblut, mit Steigerung der Tempe­ ratur des Tieres progressiv abnimmt. Sie beträgt im Durchschnitt bei 15° C bis 34,1%, bei 25° C bis 22.5%, bei 30° C bis 18,2%, bei 35° C bis 14,3%, d. h. mit andern Worten, daß die Oa-Dissozia- tionsfähigkeit des Froschhämoglobins in vivo parallel mit Zu­ nahme der Temperatur ansteigt. Die Folge davon ist eine relative wie auch absolute Zunahme der physikalisch gelösten Oa-Menge, was eine Erhöhung des Oa-Partialdruckes im Froschblutplasma zur Folge hat. Obwohl es also auf den ersten Blick scheinen könnte, daß der 35°-C-Frosch mit seinem 14.3%igen Oxyhämoglobingehalt eine Tab. V. Dissozialions kurven des Froschhämo- glohins (nach Mac ela und SeliSkar) und mittl. % Oa-Sättigung. niedrigere Oa-Spannung im Plasma aufweisen müsse als der Zim- mertemperaturfrosch mit einer Oa-Sättigung von 34,1%, haben wir in Wirklichkeit, als Folge der temperaturbedingten Änderung der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion Hb + Oa ^ HbOa, trotz der Abnahme der Oa-Sättigung mit einer Steigerung des Oa- Partialdruckes im Plasma zu rechnen. Die Richtigkeit unserer Überlegung beweist Tabelle V. Auf dieser sind die von Magela und SeliSkar gefundenen Oa-Dissoziationskurven des Froscbhämoglo- bins abgebildet und unsere Ergebnisse (mittlere prozentuale Oa- Sättigung) eingezeichnet. Tabelle V zeigt: Der Oa-Sättigung von 34,1% bei 15° C ent­ spricht pOa = 3,3 mm Hg, derjenigen von 22,5% bei 25° C ent­ spricht pOa = 4,6 mm Hg, während eine solche von 14,3% bei 35° C ihren pOa-Gegenwert bei 7,5 mm Hg findet. Da die Magela- SeliSkarsehen Kurven nun an Hämoglobinlösungen und nicht am Gesamtblut ermittelt wurden, können die obengenannten Werte nicht als absolut bezeichnet werden. Es bleibt aber, wie vermu­ tet, die Tatsache bestehen, daß trotz der Senkung der Oa-Sätti- Pathologie und Bakteriologie, Vol. X. Fase. 1 (1947) 6 66 Tc s ar z, Die Ursache der Rcsislenzdurchbrechung gung der Os-Partialdruck im Froschblut mit steigender Tempera­ tu r zunimmt. Ähnliche Feststellung haben Barcroft und King auch am menschlichen Blut gemacht. So entspricht z. B. einer O - Sättigung von 90% bei 14° und 50% hei 38° pCh von 5 mm und 21 m m H g oder einer Sättigung von 80% bei 14° und 64% bei 32° pOa von 3,5 mm und 17 mm Hg. Diese Erscheinung geht wohl sicher auf eine Änderung der Gleichgewichtskonstante für die Reaktion Hb + O ^ IlbCh zurück, woraus eine größere Menge physikalisch gelösten ()■ -■ resultiert. Zugunsten dieser Auf­ fassung spricht auch die Beobachtung von J. Henderson (45) und seinen Mitarbeitern. Sie untersuchten das Blut einer Schildkröte (Chelydra serpentina) bei 20° C und 37,5° C in vitro und fanden als respektive Werte: Freier Cb Vol.% 0,22 (pO» = 57.0 mm Hg) und 0,32 Vol.% (pCh = 130,0 mm Hg). sauer alkalisch Tab. VI. (llarlrUlge and Koughlon.) Abszisse = Wert der Geschwindigkeitskonstanle für die Reduktion. Eine weitere wichtige Tatsache ergibt sich aus Tabelle VI, die zeigt, daß: 1. die Gesell windigkeilskonstante der Reduktion des Oxy­ hämoglobins in saurer Lösung entschieden größer ist als in alkali­ scher und daß 2. dieser Unterschied mit Steigerung der Temperatur immer größer wird. Da nun am Orte der Oxydation des Hämoglobins (beim Frosch außer in der Lunge auch in gewissen Teilen der Haut) die kleinste und an der Stelle der Reduktion des Oxyhämoglobins die größte IT-Konzentration im Blute vorhanden und die Geschwin­ digkeitskonstante der Oxydation des Hämoglobins von pH und Tem peratur beinahe unabhängig ist, muß sich die der Atmung dienende, durch das Hämoglobin Iransportierte und an das Blut­ plasma und Gewebe abgehende Oz-Menge mit Erhöhung der Tem­ peratur vergrößern. Der Nutzeffekt des Hämoglobins steigt mit der Temperatur des Tieres, was sich auf die relative Hemmung des Oz-Druckabfalls im Blut wie auch die bessere 0=-Versorgung des Gewebes gleichermaßen günstig auswirken muß. am milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch Daraus ergibt sich zusammenfassend: Der theoretisch postu­ lierte, aus den angeführten Gründen direkt nicht zu beweisende Gedanke einer Zunahme der Ös-Spannung im Gewebe des w ar­ men Frosches findet in der gefundenen Steigerung der Dissozia­ tionsfähigkeit des Froschhämoglobins und der Erhöhung seines Nutzeffektes eine reale Unterlage. Was die — verglichen mit dem Menschen (arteriell 94—97%, venös 65—75%) — relativ niederen Werte des Frosches anbelangt (vgl. Tabelle IV), so erklären sie sich aus der Tatsache, daß das Herzkammerblut des Frosches arteriell-venös gemischt ist und das Froschhämoglobin an sich über eine bedeutend geringere O a - Affinität verfügt als das menschliche. Mngela und SeUSkar schrei­ ben darüber: «For obtaining the same effect in frog Hb, the pressure of O a , compared wilh that sufficient for the 50 p.c. Saturation of human Hb, must be raised at 15° C. 32 times, at 25° C. 12 times, at 35° C. 6 times.» Diese Tatsache reimt sich nicht nur mit unserer theoretischen Annahme, daß im Gewebe des kal­ ten Frosches eine sehr niedrige Oa-Spannung vorhanden sein muß, sondern läßt auch verstehen, daß sich das Froschhämoglo­ bin seiner physiologischen Hauptfunktion, nämlich der Abgabe des O an das Blutplasma und das Gewebe, auch unter ungünsti­ gen Verhältnissen, d. h. auch bei ganz kleinem Oa-Druck (wie das eben bei niedriger Temperatur der Fall ist) entledigen kann. Als weitere Ursache für die ermittelten, relativ kleinen Oa-Sättigungs- werte ist noch die mit starker Atmungsverlangsamung verbundene Narkose zu erwähnen, die wir fü r die Herzpunktion benötigten. Dadurch wurde zweifellos der für die Oa-Sältigung des Blutes und für die Oa-Spannung im Gewebe indirekt so wichtige Einfluß der Kreislauf- und Atmungstätigkeit (wir werden darauf später noch zurückkommen) verschleiert, andererseits konnte aber da­ durch der Hämoglobinfaktor in um so reinerer Form erfaßt werden. Unser nächster und letzter Schritt in der Beweisführung galt der Prüfung der Frage, ob man die Oa-Spannung im Gewebe des Frosches unter Umgehung der Temperaturerhöhung so steigern kann, daß der Frosch milzbrandempfänglich wird. Vom Ergeb­ nis dieses Versuches hing es schließlich ab, ob die Indizienbeweis­ führung, die uns mangels einer Möglichkeit, die Oa-Spannung im Gewebe direkt zu messen, aufgezwungen wurde, brauchbar war oder nicht. T c s a rz , Die Ursache der Resislenzdurehbrechuug c) Künstliche Erhöhung der Ch-Spannung im Froschblut. Wir versuchten dieses Ziel zuerst auf chemischem Wege zu erreichen. Dabei gingen wir von der Tatsache aus, daß der Frosch unter dem Einfluß der erhöhten Temperatur vegetativ umge- stimnit wird und von einer trophotropen in eine ergotrope Ein­ stellung gerät. Diese Umstimmung wird nach Nagel (46) (1935) durch die chemisch-physikalisch bedingte Änderung der Stoff­ wechsellage verursacht, wobei den endokrinen Drüsen eine wich­ tige Vermittlerrolle zuzusprechen ist. Nebst Nebenniere (Adrenalin) scheint besonders die Schild­ drüse hier ein großes Mitspracherecht zu haben [Adler, 47, u. a.). Die sympathikotonische Einstellung des Frosches begünstigt in ­ folge einer Steigerung der Lungenventilation, der Herzfrequenz, des Schlagvolumcns, der Mobilisation der Blutspeicherdepots und Kapillarisation an der Peripherie eine bessere Os-Versorgung des Gewebes. Wir versuchten deshalb die Erhöhung des Os-Druckes im Gewebe, wie sie als Folge der vegetativen Umstimmung durch Erwärmen des Frosches auf 30" C automatisch zustande kommt, bei 25°-C-Frosch durch pharmakodynamische Reizung des sym­ pathischen Systems zu erreichen. Zu diesem Zwecke injizierten wir den Fröschen in den Rückcnlymphsack täglich je 1 ccm Thyroxin «Roche» oder Adrenalin (1 : 1000) oder Thyroxin + Adrenalin,0. Gleichzeitig infizierten wir die Frösche subc.ulan mit Milz- hrandbazillen. Der Erfolg blieb aus. In keinem Fall gelang es uns, eine Milz­ brandsepsis nuszulösen, was verständlich wurde durch die Feststellung, daß weder Thyroxin noch Adrenalin bei 25° C beim Frosch eine deutliche sym­ pathikotonische Wirkung auszuüben vermochten. Auf Grund von Reaktions­ weise, Herz- und Atemfrequenz gewannen wir den Eindruck, daß es kaum mög­ lich sein dürfte, den erwachsenen Frosch mit Thyroxin oder Adrenalin so stark ergotrop zu stimulieren, wie das bei einer Temperatur von ,'!0° C geschieht. Als Beweis für die weitgehende Indifferenz der erwachsenen Frösche mag die Beobachtung dienen, daß ein Frosch bei 25" C eine einmalige Injektion von 5 ccm (!) Thyroxin ohne irgendwelche toxische Erscheinung ertrug. Dieser Mißerfolg veranlaßte uns, eine rein physikalische Methode zu versuchen. Frösche wurden 12 Std. lang bei 25° C vorgewärmt, anschließend in der üblichen Weise infiziert und zusammen mit einem nichtinfizierten Kontrollfrosch in einen Glas­ kolben verbracht. Dieser wurde mittels eines Gummizapfens ver­ schlossen, der durch ein Röhren- und Hahnsystem sowohl an 1 0 10 Für die Überlassung der benötigten Versuchsmengen sind wir der Firma Hoffmann-La Roche AG., Basel, zu Dank verpflichtet. am milzbrandinfizicrten Warmwasserfrosch eine Os-Bombe wie an eine Vakuumpumpe Anschluß finden konnte. Die Luft wurde evakuiert und durch reinen O» ersetzt. Der Anhäufung von COs im Glaskolben wirkten wir durch Auf­ hängen eines Behälters mit Natronkalk und oftmaliges Durchspü- len des Kolbens mit reinem O2 entgegen. Die Zimmertemperatur betrug durchschnittlich 25° C. Der Sinn dieses Versuches ist klar. Von der fünffachen Stei­ gerung des Ch-Partialdruckes erwarteten wir nebst einer größeren Ös-Sättigung des Hämoglobins auch eine Zunahme von physika­ lisch gelöstem O» im Blutplasma und dadurch eine Erhöhung der Os-Spannung im Gewehe. Wird die Resistenz des Frosches bei 25° C hauptsächlich durch einen fü r die ungehinderte Entwick­ lung des Milzbrandbazillus noch zu niedrigen Ch-Druck im Ge­ webe gewährleistet, so sollte die künstliche Erhöhung desselben den Weg fü r die Infektion freilegen. Die Versuchsergebnisse ent­ sprachen unsern Überlegungen. Die mit Milzbrand infizierten Oa-Frösche zeigten nach 6—10 Std. ein starkes entzündliches ödem an der Impfstelle (Rückenlymphsack) und gingen nach 50—60 Std. ein. Bei allen konnte eine eindeutige Milzbrandsepsis baktcrioskopisch und kulturell fcstgestellt werden. Milzbrand­ bazillen waren in allen Organen in großer Menge mikroskopisch nachzuweisen. Sie besaßen meistens Kapseln, lagen, praktisch genommen, fast alle extrazellulär, waren gut färbbar und mit Aus­ nahme derjenigen aus der Leber, die gelegentlich leichte Degene- rationserscheinungen zeigten, fast immer von normaler Form. Die Kontrolliere starben durchschnittlich 48 Std. später, offenbar als Folge der toxischen Einwirkung des reinen Sauerstoffes. Der Zufall wollte es, daß die Mehrzahl der milzbrandigen Frösche nachts gestorben ist. Um dem Einwand einer postmor­ talen Invasion zu begegnen, spritzten wir einigen toten Fröschen eine doppelt so große Milzbranddosis wie den lebendigen ein (2 ccm einer 24stdg. Bouillonkultur) und steckten sie l>ei 25° C in reine Oa-Atmosphäre. Die nach 24 Std. durchgeführte Sektion er­ gab, daß Milzbrandbazillen vom Rückenlymphsack her nur teil­ weise die Rückenmuskulatur und naheliegende Lungenpartien durchwandert hatten, währenddem Herzblut. Leber und Milz bak- terioskopisch und kulturell frei von Bazillen waren. Da unsere Versuchsfrösche maximal 12 Std. nach dem Tod zur Sektion kamen, ist diese «Pathogenese» der Milzbrandsepsis sicher aus­ zuschließen. T e s a r z , Die Ursache der Resislenzdurchhrechun Die Befunde an den in reiner Oa-Atraosphäre und einer Tem­ peratur von 30" C gehaltenen Milzbrandfröschen sprachen eben­ falls für die Bedeutung der O-Spannung. Entsprechend unseren Erwartungen nahm die Milzbrandsepsis unter diesen Bedingungen einen foudroyanten Verlauf. Während bei den bei 30° C gehalte­ nen Fröschen die Milzbrandbazillen kaum vor 30 Std. nach der Impfung im Blut erschienen, erlagen die Tiere in reiner Oa-Atmo­ sphäre der Infektion schon nach 12— 16 Std., wobei die Organe geradezu von Milzbrandbazillen strotzten. In einer dritten Serie versuchten wir die Temperatur auf 20" C hinunterzudrücken. Dabei verhielten sich die Tiere nun nicht nur gegenüber der Infektion, sondern auch gegenüber der reinen Os-Atmosphäre — sie wurde wochenlang schadlos ertra­ gen — vollkommen refraktär. Auf Grund der früheren Überlegun­ gen und Versuchsergebnisse lag es nahe, die Resistenzdurchbrc- chung über eine weitere Steigerung des Oa-Druckes zu versuchen. Dabei zeigte sich aber, daß selbst eine Druckerhöhung auf 3 Ata, welche die Frösche durchschnittlich 72 Std. überlebten, allein und in Kombination mit Adrenalin nicht imstande war, die Infektion zum Haften zu bringen. Angesichts dieser Sachlage stellte sich die Frage nach der Vermehrungsintensität der Milzbrandkeime bei 20° C, d. h. es mußte untersucht werden, inwieweit die Resistenz des Frosches nicht einfach die Folge einer temperaturbedingten Entwicklungs­ hemmung der Milzbrandbazillen war. Dabei ergab sich (siehe Tabelle VII) die überraschende Tatsache, daß sich der Milzbrand­ bazillus bei 20° C 70 OOOmal langsamer vermehrt als bei 30° C, wogegen die entsprechende Reduktion bei einer Temperaturab­ nahme von 30 auf 25° C nur 2 'A beträgt. Der Milzbrandbazillus findet sich also bei einer Temperatur von 20" C so weit von sei­ nem Temperaturoptimum entfernt, daß die an sich wohl schwa­ chen natürlichen Abwehrkräfte des Froschkörpers genügen, um seine Entwicklung überhaupt zu verhindern. Daß angesichts die­ ser Vita minor, in der sich der Milzbrandbazillus befindet, eine unter andern Verhältnissen wichtige Ch-Zufuhr nicht ausreicht, um seine Ix-bensbedingungen als Voraussetzung zur erfolgreichen Infektion zu verbessern, erscheint wohl verständlich. Auf Grund dieser Versuchsergebnisse kommen wir also zu folgender Auffassung über die Ursachen der Milzbrandresistenz des Kaltwasserfrosches. An der Milzbrandresistenz des kalten Fro­ sches sind mindestens drei Faktoren beteiligt: am milzbrandinfizicrlen Warnrwasserfrosch 71 1. Temperaturoptimum des Bazillus, 2. Os-Spanmmg des Gewebes, 3. Zell- und Säftebakterizidie, wobei je nach der Temperatur das Hauptgewicht bei der ersten oder zweiten Komponente liegt. Die Erhöhung der Temperatur auf 25° C schaltet praktisch den hemmenden Einfluß der niedri­ gen Temperatur aus und verringert aller den des relativ niedrigen Oa-Druckes offenbar nur ungenügend. Deswegen kommt es wohl TABELLE VII. Einfluß der Temperatur auf das Wachstum des Milzbrandbaziltus. Temp. Keimzahl in Mill./l ccm Mittlere Keimzahl 0 h. 24 h. ca 0,0003 01 57 Millionen 25° C . 0,0003 06 . 0,0005 52 „ 0,0005 49 30« C . . 0,0005 200 137 Millionen , 0,0005 120 , 0,0005 . 0,0005 98 20° C » 0,0001 0,00075 915 „ 0,0001 0,00112 „ 0,0001 0,00082 „ 0,0001 0,00097 30° C . 0,0001 51 68 Millionen „ 0,0001 89 „ 0.0001 „ 0.0001 64 zu einer stärkeren Vermehrung der Milzbrandbazillen, die aber wahrscheinlich dank der vermehrten Leukocytenaktivität (Nuttal, Kodama) doch noch vernichtet werden. Beseitigt man aber auf künstlichem Wege («Sauerstoff-Frösche») auch die hemmende Wirkung der fü r den Bazillus mangelhaften Oa-Versorgung, so bricht die Infektion durch. Dasselbe, d. h. die Erhöhung der Oa- Spannung im Gewebe bis zu Werten, die dem Oa-Optimum der Milzbrandbazillen nahekommen, wird sehr wahrscheinlich auch durch die Steigerung der Temperatur auf 30° C erreicht. Es fallen also bei 30° C beide das Wachstum des Milzbrandbazillus hem ­ menden Faktoren (Temperatur und niedriger Oa-Druck im Ge­ webe) weg, und die — wenn auch an sich nicht sehr bedeutenden 72 T e s a r z , Die Ursache der Resistenzdurchbrechung natürlichen — Schutzkräfte des Froschkörpers erliegen dem da­ durch verstärkten Ansturm der Bazillen. Tabelle VIII stellt die Ergebnisse der in diesem Kapitel beschriebenen Versuche kurz zusammen. TABELLE VIII. Sauerstoff Temp. Unter normalen Adrenalin Thyroxin Adrenalin 1 Atm. 3 Atm. 3 Atm. Umständen + Thyroxin + Adr. 20» 25° f nach 50-00 Std. 300 f nach t nach 28-48 Std. 12 16 Std. — = keine Milzbranderkrankung; f = Tod und Milzbrandsepsis. Diskussion. Gleich zu Beginn der Besprechung unserer Versuchsergeb­ nisse wollen wir die Tatsache festhalten, daß die Resistenzdurch­ brechung des milzbrandinfizierten Warmwasserfrosches, entgegen der Auffassung einiger älterer Autoren (Lubarsch, Nuttal, Sana- relli), als ein echter Infektionsvorgang aufzufassen ist, trotzdem auch der nicht-infizierle Frosch bei Temperaturen über 28° C nach einer gewissen Zeit (jedoch immer 12— 48 Std. später als der milzbrandinfizierte) verendet. Welcher Natur die das nicht-in- fizierte Tier tötende Temperaturschädigung ist, haben wir nicht untersucht. Unsere erste Arbeitshypothese zur Erklärung der Resistenz­ durchbrechung erwies sich als falsch. Die mit Steigerung der Tem­ peratur stattfindende Abnahme der IT-Konzentration ließ die An­ nahme einer immunbiologischen pH-Schädigung des Froschblutes nicht aufrechterhalten. Dennoch erweisen sich unsere pH-Mes­ sungen vom biologischen Standpunkt aus interessant. Sie beweisen, daß die Konzentration des frei im Blutplasma gelösten COa umge­ kehrt proportional der Temperatur ist, eine Erscheinung, die auch von von Werz anläßlich von Abkühlungsversuchen an Kat­ zen und Kaninchen beobachtet wurde. Dem kalten Frosch kommt der große COa-Druck im Plasma zugute, weil der erhöhte pH die zufolge der niedrigen Temperatur geringe Dissoziationsfähig­ keit des Oxyhämoglobins begünstigt. Hier finden sich sogar An­ knüpfungspunkte an die alte Theorie von Petrm chky, der, sich auf die Fränkelsche Beobachtung der milzbrandfeindlichen W ir­ kung der Kohlensäure stützend, diese als einen ins Gewicht fal­ am lnilzbrandinfizicrten Warmwasserfrosch lenden Faktor fü r die Milzbrandresistenz betrachtete. Petruschky erklärte denn auch die Entwicklung der Milzbrandbazillen im er­ wärmten Frosch sowie ihre Vermehrung im hängenden Frosch- lymphtropfen — in vivo erfolgte in der Lymphe kein Wachs­ tum — mit der verminderten COs-Spannung. Seine Versuche, den Einfluß des COs im lebenden Froschkörper auszuschalten (Aus­ treibung mit stärkeren Säuren oder Bindung mit Alkalien), blieben allerdings resultallos. Es gelang ihm nur, in bei Zimmertemperatur gehaltenen Fröschen durch Vorimpfung mit Milchsäurebazillen oder Barythydratbehandlung ein kümmerliches Auswachsen der Milzbrandsporen zu beobachten. Die Petruschkysche Hypothese wurde nachher nie weiter nachgeprüft; detaillierte Angaben über den milzbrandfeindlichen Einfluß der Kohlensäure und die Werte der CCh-Spannung im Froschgewebe sind uns nicht bekannt geworden. Da aber die Os-Spannung im Gewebe mit steigender Temperatur wächst und der CCh-Druck abnimmt, ist cs trotz der in vitro nachgewiesenen Bedeutung des Oj für die optimale Entwicklung der Milzbrand­ bazillen nicht ausgeschlossen, daß die infektionsfördernde W ir­ kung des O2 durch die COa-Verarmung noch verstärkt wird. Die zweite Arbeitshypothese stieß auf die von uns nicht zu behebende Schwierigkeit der direkten pOa-Messung im Gewebe, so daß wir uns mit einer indirekten Beweisführung — Bestim­ mungen des Oxyhämoglobingehaltes im Blut bei verschiedenen Temperaturen — zufrieden geben mußten. Wir fanden, daß die Oa- Dissozialionsfähigkeit und der Nutzeffekt des Froschoxyhämo­ globins in vivo mit Zunahme der Tiertemperatur größer wird. Dies spricht zugunsten der Auffassung, daß die Oa-Spannung im Gewebe des Frosches mit der Temperatur ansteigt. In dieser An­ nahme wurden wir durch Vergleiche der Verhältnisse bei W arm ­ blütern und theoretische Überlegungen bestärkt. Ehrlich 11 glaubte anhand seiner Versuche, daß die Oa-Spannung im Gewebe gleich null sei. Dies erwies sich später, wenigstens was die Warmblüter betrifft, als ein Irrtum . So hat Kroyh 12 z. B. festgestellt, daß pO= im frischen Urin 35 mm Hg beträgt. Verzär (48) fand für die Spei­ cheldrüsen 44 mm Hg und in willkürlichen Muskeln ca. 20 mm Hg pOa. Campbell (49) hat bei Kaninchen und Katzen den O2 - Druck im unter die Haut und in die Abdominalhöhle injizierten Gas gemessen und als Resultat von ungefähr 300 Bestimmungen 11 Zitiert nach J. A. Campbell (49). 15 Zitiert nach J. A. Campbell (49). T e s a r z , Die Ursache der Rcsislenzdurchbrechung gefunden, daß die Ch-Spannung im Unterhautgewebe 20—30 mm Ilg, in der Abdominalhöhle ca. 30—40 mm Hg beträgt. Den Un­ terschied der Werte führt er auf die bessere Durchblutung der Bauchorgane zurück. W ir sehen also, daß pO> im Gewebe der W armblüter einen Bruchteil, nämlich Vs bis Vs der normalen Luftsauerstoffspannung darstellt und demnach für die Entwick­ lung des Milzbrandbazillus bereits unter dem Optimum liegt. Für die Vermehrung des Milzbrandbazillus durchaus ungenügend dürfte der p O im Gewebe der Kaltblüter werden, das wahrschein­ lich nur noch einen minimalen Os-Partialdruck aufweist. Diese Erkenntnis ergibt sich aus einer Analyse der Faktoren, welche für den pOs im Gewebe bestimmend wirken. Das ist in erster Linie der pOs in den Kapillaren, der seinerseits von folgenden Faktoren abhängig ist. 1. Os-Partialdruck in der Lungenalveole (Art der Lungenventi­ lation) . 2. Os-Kapazität des Blutes: a) Eindickung des Blutes durch Wasseraufnahme vom Ge­ webe. b) Kontraktion der Milz. c) Zunahme des Färbe-Index. 3. Das Blutvolumen, welches in der Zeiteinheit die Gewebsein- heit durchströmt: a) Pulsfrequenz. b) Schlagvolumen des Herzens. c) Änderung im Vasomotorentonus. d) Kapillarisation des Gewebes. 4. Koeffizient der Utilisation des Hämoglobins: a) Artbedingte, spezifische Ch-Affinität. b) Temperaturbedingte O-1 -Dissoziationsfähigkeit. 5. Diffusionskoeffizient des Oj: a) Lungenalveole — > Kapillarblut in der Lunge. b) Kapillarblut an der Peripherie — > das Gewebe. Im Lichte dieser Erwägungen rückt das Problem der Os- Spannung im Gewebe des kalten und erwärmten Frosches unserem Verständnis näher. Der kalte Frosch (z. B. 10° C) ist ausgespro­ chen trophotrop eingestellt. E r ist träge und langsam in seiner am milzbrandinfizierlen Warmwasserfrosch Reaktionsweise, sehr wenig beweglich, Pupille klein, schlitzförmig. In geduckter Haltung verweilt er meistens unter dem Wasser­ spiegel. Dementsprechend ist seine Atemfrequenz praktisch gleich null. Herzschlag 25—30/min. Entsprechend dieser vagotonischen Einstellung und dem langsamen Stoffwechsel ist die Os-Spannung im Gewebe des kalten Frosches sicherlich ganz niedrig, worauf auch unsere Oxyhämoglobinmessungen hinweisen. Auch Brown und Hill trugen dieser Erscheinung Rechnung und glauben, daß der Temperaturrückgang bei Kaltblütern mit einer Senkung des Os-Druckes auf minimale Werte verbunden ist, was sich in äußer­ ster Verlangsamung der regenerativen Prozesse in den Muskeln widerspiegeln soll. Der warme Frosch weist eklatante Unterschiede auf. Er ist eindeutig sympathikotonisch eingestellt. Hoch aufgerichtet, ge­ spannt, von lebhafter Reaktionsweise, Pupille weit aufgerissen. Atemfrequenz 15—20/min., Herzschlag 55—65/min. Die Os-Kapa- zität des Blutes nimmt mit der Temperatur zu; auf 100 ccm Blut berechnet, beträgt sie l>ei 15° C — 14,07, 25° G — 14,81, 35° C — 15.78. Wir dürfen annehmen, daß sich auch Vasomotorentonus und Kapillarisation des Gewebes im Sinne der besseren Oa-Ver- sorgung ändern. Dazu kommt nun noch der überaus wichtige Hämoglobinfaktor. Unter diesen Umständen sind wir zur Fest­ stellung berechtigt, daß gemäß der sympathikotonischen Lage und größerer Dissoziationsfähigkeit sowie erhöhtem Nutzeffekt des Hämoglobins der Os-Partialdruck im Gewebe des warmen Frosches parallel der Stoffwechselzunahme eine erhebliche Steigerung e r­ fährt. Einen Begriff von der Größe dieser Steigerung gibt uns die Vergleichung der Lungenventilation. Der kalte Frosch, der meistens unter dem Wasserspiegel verweilt, besitzt natürlich einen minimalen Os-Partialdruck in der Lunge, welcher jedoch beim warmen Frosch mit seinen 15—20 Atembewegungen/min., relativ gesehen, eine sehr große Zunahme aufweisen muß. Oh die An­ passungsvorgänge, die eine bessere Oi-Versorgung des Gewebes sicherstellen, mit der Steigerung des Os-Bedarfs der Zellen bei höheren Temperaturen Schritt halten, ist eine andere Frage. Je­ denfalls erlauben uns die durchgeführten Untersuchungen und theoretischen Erwägungen, folgende Schlüsse zu ziehen: Vergleicht man die obengenannten, für den pOs in Kapillaren und Os-Versorgung des Gewebes wichtigen Faktoren beim W arm ­ blüter und kalten Frosch, so kommt man zur Überzeugung, daß der pOs im Gewebe des Kaltfrosches beträchtlich niedriger sein 76 Te s ar z, Die Ursache der Kesisteuzdurchbrechung muß als im Warmblütergewebe. Da im letzten der pCb durch­ schnittlich 20—30 mm Hg hoch ist, dürfen wir annehmen, daß er im Gewebe des Kaltfrosches auf Werte herabsinkt, die sich um den Nullpunkt bewegen. Gaarder (50) gibt an, daß der Ch-Druck eines Teiles des Karpfengewebes unter normalen Verhältnissen gleich null ist. Die Erwärmung des Frosches auf 30“ C bewirkt durch Änderung der Gleichgewichtskonstante der Reaktion Hb + Oj ^ HbOs sowie Umstellung der vegetativen Lage und des Stoff­ wechsels eine erhebliche Steigerung des Os-Druckes im Gewebe, die wahrscheinlich mehrere mm Hg beträgt. Diese quantitativen Feststellungen sind sehr bedeutsam für die Beurteilung der punkto Milzbrandresistenz und Milzbrand­ empfänglichkeit wichtigen immunbiologischen Bedeutung für die 0 - Spannung im Froschgewebe. Unsere Versuche über die Abhän­ gigkeit der Wachstumspotenz des Milzbrandbazillus von der Os- Spannung in vitro lassen klar erkennen, daß die Vermehrungs­ intensität des Milzbrandbazillus durch den O-Mangel deutlich, und zwar besonders stark bei den absolut kleinen Werten (pOs = 1— 6 mm Hg) gehemmt wird. Gegenüber der Vermehrungsinten­ sität bei freiem Luftzutritt ist die Wachstumspotenz bei pOs = 1 mm Hg lGGinal kleiner, wogegen bei p O = 10 mm Hg nur um das öfache. bei pO» = 20 mm Hg sogar nur um das 2,6fache ab­ nimmt. Da wir an Hand obiger Erwägungen im Gewebe des kalten Frosches wahrscheinlich mit einer minimalen O -Spannung rech­ nen dürfen, ist anzunehmen, daß die Milzbrandresistenz des kal­ ten Frosches in hohem Maße durch die absolut kleine Os-Span- nung im Gewebe bedingt wird. Demgegenüber ist die Erwärmung des kalten Frosches auf 30° C von einer solchen Steigerung des Oa-Druckes begleitet, daß sich hieraus für das Wachstum des Milzbrandbazillus keine Hinderung mehr ergibt. Nun haben aber weitere Untersuchungen gezeigt, daß die Milzbrandresistenz des 20°-C-Frosches mittels der bei 25° C wirk­ samen Os-Spannung nicht durchbrochen werden konnte. Dieser Mißerfolg, der auf den ersten Blick gegen unsere Hypothese spricht, wurde durch Untersuchung über den Einfluß der Tem­ peratur auf das W achstum des Milzbrandbazillus aufgeklärt. Es zeigte sich nämlich, daß die Vermehrungsintensität des Milzbrand­ bazillus bei einer Temperatur von 20" C 70 OOOmal geringer als bei 30° C. d. h. praktisch auf ein Minimum reduziert ist. An der Milzbrandresistenz des Frosches bei 20° C und darunter sind so­ am milzbrandinfizierlen Warmwasserfrosch mit theoretisch 2 Faktoren beteiligt, praktisch wird jedoch der an sich entwicklungshemmende Einfluß der ungenügenden Ch- Spannung im Gewebe durch die Abweichung vom Temperatur­ optimum der Milzbrandbazillen vollkommen überdeckt. Mit dem Anstieg der Tiertemperatur von 20° C auf 25° C wird die temperaturbedingte Wachstumshemmung des Milzbrand­ bazillus überwunden — die Vermehrungsintensität des Erregers bei 25° C ist nur rund 2 'Amal kleiner als bei 30° C. Jetzt kommt aber noch ungenügende (L-Spannung zur Geltung und übernimmt gewissermaßen die Führung im Kampfe um die Erhaltung der Milzbrandresistenz des Frosches. Im Gegensatz zum unüberwind­ lichen Hindernis der Temperatur — die Züchtung eines virulenten Milzbrand-Kaltstammes gelang uns nicht — konnte das Hindernis des für den Milzbrandbazillus ungenügenden CL-Druckes durch bessere ÜJ-Zufuhr überwunden werden. Dieser Vorgang stellt sich hei der Erhöhung der Temperatur auf 30° C automatisch ein. Jetzt vermögen die natürlichen Abwehrkräfte des Froschorganis­ mus dem verstärkten Ansturm der Milzbrandbazillen nicht mehr standzuhalten. Die Milzbrandresistenz des Frosches wird durch­ brochen. Steigert man hei 30“ C zusätzlich den pOs, so wird der Frosch, entgegen unserer Hypothese, noch früher septisch. Im Lichte dieser Beobachtungen scheint die natürliche Zell- und Säftebakterizidie des Frosches nur in minimaler Weise an der Milzbrandresistenz beteiligt zu sein. Dagegen ergibt sich aus diesen Untersuchungen, wie sehr rein physiologische Gesichts­ punkte hei der Beurteilung von Gast-Wirt-Beziehungen zu berück­ sichtigen sind. Zusammenfassung, An der Milzbrandresistenz des kalten Frosches sind die nach­ stehenden. in der Reihenfolge ihrer Wertigkeit aufgeführten F ak­ toren beteiligt: 1. Temperatur, deren bakteriostatischer Einfluß sich auch in vitro erfassen läßt, und der bei 20° C und darunter nicht über­ brückt werden konnte. 2. O2 -Druck im Froschgewebe, dessen entwicklungshem­ mende Wirkung ab 25° C durch gesteigerte Ch-Zufuhr behoben werden konnte. 3. Eine bescheidene Zell- und Säftebakterizidie, die nur heim Spielen wenigstens einer der beiden wirksamen Komponenten zur Auswirkung gelangen kann. T rsarz, Die Ursache der Kesistcii/durchbrechnng Résumé. La résistance de la grenouille froide à l'infection charbon­ neuse dépend des facteurs suivants, classés par rang d’impor­ tance : I o La température, dont l’effet bactériostatique peut être mis en évidence même in vitro et s’avère insurmontable à 20° C. et au-dessous. 2° La tension d ’oxygène dans les tissus de la grenouille ; l'effet inhibiteur qu’ils exercent sur la croissance peut être neu­ tralisé à partir de 25° G. par un apport supplémentaire d’0 2. 3° Le pouvoir bactéricide modeste des cellules et des humeurs, qui ne peut toutefois intervenir que lorsque l’une au moins des conditions requises ci-dessus se trouve remplie. Riassunto. Nella resistenza del carbonchio della rana fredda trovasi una partecipazione dei seguenti fattori, messi neU’ordine della loro valenza: 1. ° Della temperatura, il di cui influsso bacteriostatico si puó anche afferrare in vitro e che non si poté sorpassare avendo una temperatura di 20° e meno. 2. ° Della pressione dell’ossigeno nel tessuto della rana. Si poté aboliré l’effetto arrestante lo sviluppo mediante un’afflusso aumentato d’ossigeno a partiré di gradi 25. 3. ° D’una modesta bactericidia di cellule e di sueco, la quale non puó diventare effettiva che in presenza di almeno una delle due componenti effettive. Summary. The resistance of the frog to anthrax is dependent on the following factors: 1. Temperatures below 20° C. exert a bacteriostatic effect as could also be demonstrated in vitro. 2. Low oxygen-pressure in the frog’s tissues. The resistance of the frog to anthrax infection can he eliminated by increased oxygen-pressure at temperatures of 25" C. and higher. 3. A low grade bactericidal property of the tissues and of the blood. Both are eliminated either by increased temperature or by increased oxygen-pressure. am milzbrandint’iziertcn Warm wasser frösch Literatur. 1. Koch, li., Colins Beilr. z. Biol. d. Pfl. 2, 1876, 284. — 2. Gibier, Compt. rend, de l’acad. sc. .94, 1882, 1605. — 3. Pasteur, Joubert et Chamberland. Compt. rend, de l'acad. sc. 87, 1878, 17. — 4. Metschnikoff, E., Virchows Archiv 97, 1884, 502. — 5. Lubarsch, O., Zbl. f. Bakt. Orig. C, 1889, 481. — 6. ließ, C., Virchows Archiv 109, 1887, 365. — 7. Nuttal, G., Zsclir. f. Hyg. 4, 1888, 353. — 8. Petruschky, J ., Zieglers Beilr., 3, 1888, 359; Zschr. f. Ilyg. 7. 1889, 75. — 9. Fahrenholtz, G., Zbl. f. Bakt. Bef. 7, 1890, 199. — 10. Voswin- kel, Fortschr. d. Med. 8, 1890, 10. — 11. Fischei, F., Fortschr. d. Med. 9. 1891, 2. — 12. ¡{ohrschneider, K., Zieglers Beitr. 9, 1891, 515. — 13. Sanarelli, G., Zbl. f. Bakl. Orig. 9, 1891, 467. — 14. Klein und Coxwell, C., Zbl. f. 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Die Ursache der Resistenzdurchbrechung am milzbrand-infizierten Warmwasserfrosch

Pathobiology , Volume 10 (1): 30 – Jan 1, 1947

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Publisher
Karger
Copyright
© 1947 S. Karger AG, Basel
ISSN
1015-2008
eISSN
1423-0291
DOI
10.1159/000159612
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Abstract

(Aus dom Hygienischen Instilul der Universität Zürich.) D ie U r s a c h e d e r R e s is te n z d u r c h b r e c liu n g a m m ilz b r a n d - in f iz ie r te n W a r m w a s s e r f r o s c h 1 . Von ZYGMUNT TESARZ. I. Einleitung. R. Koch (1) wies in seiner ersten, aus dem Jahre 1876 stam­ menden Arbeit über die «Bakteriologie der Milzbrandkrankheit» darauf hin, daß es ihm nicht gelungen sei, Frösche durch Impfung mit größeren Stücken Milz von an Milzbrand gestorbenen Mäusen zur Erkrankung zu bringen. Sechs Jahre später aber hat Gibier (2) gezeigt, daß die Resistenz des Frosches gegen Milzbrand durch Steigerung der Temperatur durchbrochen werden kann. Von 20 mit Milzbrand infizierten und bei 35—37° C gehaltenen Frö­ schen verendeten 5 mit Zeichen der Milzbrandsepsis. Gibier hat diesen fü r weitere Untersuchungen grundlegenden Versuch auf Anregung von Pasteur (3) ausgeführt, der zu dieser Zeit den Ein­ fluß der Temperatur auf die Resistenz studierte. Zusammen mit Joubert und Chamberland sah er die Ursache der Resistenz der Vögel gegen Milzbrand in der hohen Temperatur ihres Blutes und suchte seine Theorie dadurch zu beweisen, daß er Hühner durch Eintauchen in kaltes Wasser und permanente Abkühlung milz­ brandempfänglich machte. Der Gibiersche Warmwasser-Frosch­ versuch war also nichts anderes als die Wiederholung des H ühner­ experimentes mit umgekehrten Vorzeichen. Die Beobachtungen von Gibier fanden in der wissenschaft­ lichen Welt bis zu Metschnikoff (4) wenig Echo. Er aber baute seine Phagocytose- und zelluläre Immimitätslehre unter anderem auf Froschversuchen mit Milzbrand auf. Eine Wiederholung des Versuches von Gibier zeitigte ungefähr das gleiche Resultat. Von 15 mit tierischem Material infizierten und bei 38° C gehaltenen Fröschen starben im Verlaufe von 1 bis 3 Tagen 6 an Milzbrand. Freilich gingen — wie Gibier ebenfalls bereits beobachtet hatte — die Kontrollfrösche fast zu gleicher Zeit zugrunde. 1 Die Publikation erfolgte mit Unterstützung des Fonds für Nationale Kultur (Fundusz Kultury Narodowej). Eingegangen am 12. März 1940. Te s ar z, Die Ursache der Resistenzdurchbrechung . . . F ü r das Empfänglichwerden des warmen Frosches für Milz­ brand machte Metschnikoff die Ausscheidung von Leukozidinen und die in ihrem Gefolge eintretende Sistierung der Phagocytose verantwortlich. Da die Phagocytoselehre damals im Zentrum der Imunitätsforschung stand, ist es nicht erstaunlich, daß sich sehr zahlreiche Forscher (Lubarsch, 5; Heß, 6; Nuttal, 7; Petruschky, 8; Fahrcnholtz, 9; Voswinkcl, 10; Fischei, 11; Rohrschneider, 12; Sanarelli, 13; Klein und Coxwell, 14; Terni, 15; Dieudonné, 16; Ditthorn, 17; Preisz, 18; Galli-Valerio und Vourloud, 19; Kodanut, 20) um die Jahrhundertwende herum des Froschmilzbrandes an- nahmen. Wir verzichten darauf, alle die sich oft widersprechen­ den Ergebnisse der obengenannten Forscher anzuführen, und be­ schränken uns auf die Wiedergabe der in diesem Zusammenhang geäußerten grundsätzlichen Gedanken. Während Metschnikoff die Erklärung der Milzbrandresistenz des Frosches ausschließlich in der Phagocytose gesucht halte, haben andere Autoren gezeigt, daß die Milzbrandbazillen im Froschleibe auch extrazellulär zugrunde gehen. Petruschkij, Fah- renholtz und später Preisz sprachen den Froschleukocyten sogar jegliche Bedeutung für die Destruktion der Milzbrandbazillen ab und meinten, die Leukocyten dienten nur der Beseitigung toter Bazillen und deren Fragmente. Voswinkel berichtet, daß bei Zim­ mertemperatur gehaltene leukocytenarme Frösche (sog. «Koch- salzfröschc») die eingeführten Milzbrandbazillen in 6 Tagen voll­ ständig vernichten. Sanarelli schreibt: «Die Froschlymphe übt auf Milzbrandbazillen eine deutliche degenerative Wirkung aus, un­ abhängig von jedem Einfluß der Leukocyten.» Galli-Valerio und Vourloud sahen das Wesen der Resistenz der Kaltblüter in zwei Faktoren: «Les phagocytes et le pouvoir bactériolytique des h u ­ meurs.» Sehr aufschlußreich sind die Untersuchungen von Ko- dama aus dem Jahre 1913, womit das Thema der Milzbrandresi­ stenz des Frosches aufgehört hatte, die Mikrobiologen zu inter­ essieren. Dem Serum und dem «Ascites» des Frosches kommt nach Kodama keine bakterizide Wirkung zu. Dagegen hat das Serum die Eigentümlichkeit, die Vermehrung und die Kapselbil­ dung der Milzbrandbazillen zu hemmen. Außerdem ist die niedrige Körpertemperatur des unter normalen Verhältnissen lebenden Fro­ sches der Vermehrung der Milzbrandbazillen nicht zuträglich. Als wichtigsten Abwehrmechanismus bezeichnet Kodama wiederum die Phagocytose. Wenn man kapselhaltige Milzbrandbazillen Zim- mertemperatnrfröschen einimpft, so verschwinden zunächst die 5* Te s a rz , Die Ursache der Kesislcnzdurchbrechung Kapseln, worauf sie von den Leukocyten allmählich phagocytiert werden. Die Langsamkeit der vollständigen Vernichtung der Milz­ brandkeime im Froschkörper ist jedoch auffallend. Nuttal und gleichzeitig Petnischkij haben l(i bzw. 20 Tage nach der Impfung noch virulente Milzbrandkeime im Froschkörper feslgestellt. Ditt- horn gelang es durch Zufall, noch 3 Monate nach der Impfung im Rückenlymphsack lebende Milzbrandbazillen zu finden, die sich für Mäuse fast voll virulent erwiesen. Derselbe Autor hat auch eindeutig bewiesen, daß die Milzbrandbazillen im Frosch­ körper nicht an Virulenz verlieren. Titrationen an Mäusen zeigten im Gegenteil, daß die Virulenz nach 20 Froschpassagen zugenom­ men hatte. Die Untersuchungen über die Ursache der Resistenzdurch- brecluing, von Gibier und Metschnikoff inauguriert, gingen eigent­ lich mehr nebenher. Nuttal stellte Versuche mit Fröschen bei verschiedenen Temperaturen an. Bei 23° C beobachtete er, im Gegensatz zu den Versuchen bei niederer Temperatur, eine starke Vermehrung der Bazillen, gleichzeitig schien aber auch die Tätig­ keit der Leukocyten gesteigert zu sein, denn die Milzbrandbazillen gingen trotz anfänglicher Vermehrung schneller zugrunde als in kalten Fröschen. Bei 25—30° C starben die Frösche innerhalb 23—42 Std. mit spärlichen Zeichen von Milzbrand. Die Kontroll- frösche gingen in fast ebenso kurzer Zeit zugrunde. Bei 30—37° C vermehrten sich die Milzbrandbazillen üppig. Alle Tiere starben innert 14 Std. Die Phagocytose war ganz geringgradig. Die Resi­ stenzdurchbrechung betrachtet Nuttal als Folge der mit höherer Temperatur einhergehenden Herabsetzung der Lebensenergie der Frösche. Der widerstandslos gemachte Körper wird, wie der von nach dem Tode infizierten Fröschen, von den Milzbrandbazillen ungehemmt durchwachsen. Ähnlicher Ansicht waren auch Lu- barsch und Sanarelli, die von einer durch die Temperaturerhöhung ausgelösten Schädigung des Gesamtstoffwechsels sprechen. Pe- truschky führte das Angehen der Milzbranderkrankung bei den zwischen 25—30° C gehaltenen Fröschen auf die tem peratur­ bedingte größere Wachstumsenergie der Bazillen und die Vermin­ derung der Kohlensäurespanmmg im warmen Frosch zurück, wo­ bei er sich auf Ergebnisse von Frankel (21), Pasteur und Joubert - sowie Szpilmann 3 stützte, die eine schädigende Wirkung der Koh- * 3 5 Zitiert nach Frankel (21). 3 Zitiert nach Frankel (211. am milzlirnmlinfiziorten VVnrmwasserfrosch 53 lensäure auf die Milzbrandbazillen festgestellt hatten. Eigene experimentelle Beweise für diese Hypothese zu erbringen gelang Petruschky nicht. Fahrenholz meint, die Milzbrandresistenz des kalten Frosches sei durch die relativ niedrige Temperatur und die «Ungunst des Nährbodens» bedingt, was durch die Temperatur­ erhöhung beseitigt werden sollte. Nach Rohrschneider bildet eine Temperatur von 28° C die untere Grenze, bei der eine Entwick­ lung der Milzbrandbazillen im Froschkörper erfolgen kann. Ober­ halb 28° C gehen sämtliche infizierten Frösche an Milzbrand zu­ grunde. Durch Fütterung konnte Rohrschneider auch bei warmen Fröschen keine Milzbrandinfektion auslösen. Dieudonné führte die Milzbrandresistenz des Frosches teilweise darauf zurück, daß die eingeimpften Bazillen l>ei der Temperatur des normalen Fro­ sches nicht zur Entwicklung gelangen. Gestützt wurde diese Auf­ fassung durch die Beobachtung, daß ein während längerer Zeit bei 12° C gezüchteter Milzbrandstamm nunmehr üppig wuchs und dann auch die kalten Frösche zu infizieren vermochte. Dar­ aus zog Dieudonné den Schluß, daß die Ahwehrkräfte des Frosch­ organismus nicht besonders entwickelt sind, reichen sie doch nicht weiter, als um der durch das plötzliche Überpflanzen in völlig veränderte Bedingungen an und für sich schon sehr geschwächten Bakterien Herr zu werden, während die vorher wenigstens an die Temperatur angepaßten Bazillen ihnen erfolgreichen Widerstand leisten. Die von Dieudonné mit dem «Kaltstamm» erzielten Ergeb­ nisse wurden neuerdings durch Lederer (22) bestätigt, der mit einem längere Zeit bei 10— 12° C gezüchteten Milzbrandstamm auch kalte Frösche regelmäßig erfolgreich zu infizieren vermochte, womit die älteren Untersuchungen von Galli-Valerio und Vour- loud, die einen Milzbrandstamm wochenlang bei Zimmertempera­ tur (18—20" C) züchteten, ohne damit dessen Pathogenität für die kalten Frösche erreichen zu können, widerlegt worden sind. Aus dieser die wesentlichen Daten berücksichtigenden, histori­ schen Übersicht geht jedenfalls hervor, daß das Problem der Resi- stenzdurchbreclnmg im milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch bisher nicht gelöst worden ist. Die Interpretationen, die die Auto­ ren ihren Versuchsresultaten gaben, bleiben meistens reichlich spekulativ, die Versuchsergebnisse selbst häufig widerspruchsvoll. Dies und die grundsätzliche Bedeutung, welche der Resistenz und ihrer Durchbrechung zukommen, veranlaßten uns, dieses alte Pro­ blem erneut zu bearbeiten und dabei Methoden heranzuziehen, die von der üblichen immunisatorischen Betrachtungsweise abwei- T e s a r z , Die Ursache der Resislenzdurchbrcchung dien. Dazu bewegte uns die bereits alte Erkenntnis, daß die Phä­ nomene der Phagocytose und der Säftebakterizidie liei weitem nicht für die vollständige Erklärung der Milzbrandresistenz aus­ reichen. Zwischen der Resistenz einer Tierart und der anthrako- ziden Wirkung ihres Blutserums und der Phagocyten in vitro be­ steht kein Parallelismus. Wenn sich vielleicht auch viele Wider­ sprüche älterer Versuche durch die mangelnde Berücksichtigung der Kapsel verstehen lassen, so bleibt es doch nach wie vor unver­ ständlich, daß das Blutserum einer hochempfänglichen Tierart, wie z. B. der Kaninchen, in vitro Milzbrandbazillen sehr energisch abtötet, während andererseits das Hunde- und Hühnerserum, also das Serum zweier refraktärer Tierarten, so gut wie jeder bakteri­ ziden Wirkung ermangelt. Es scheint also, daß die Resistenz ein komplizierteres Phänomen darstellt, bei dem nebst Phagocytose und Bakterizidie noch andere, zurzeit wohl noch unbekannte Faktoren eine Rolle spielen müssen. Nichts berechtigt uns zur Annahme, daß cs bei den Kaltblütern bzw. bei den Fröschen anders sein sollte. Die immunologischen Phänomene der Kalt­ blüter unterscheiden sich prinizipiell nicht von denen der W arm ­ blüter. Schwarzmonn (23) wie auch Ehert (24) haben die Bildung von Agglutininen und Präzipitinen im Frosche nachgewiesen. Man kann Frösche auch anaphylaktisch machen und die Anaphylaxie passiv übertragen (Friede und Ehert, 25; Friede, Messik, Schachun- janz, 26). Die Erhöhung der Temperatur übt einen günstigen Einfluß auf die Antikörperbildung aus (W idal und Sicard*, Ehert). Da also die humoralen Immunitätserscheinungen im Froschorganismus grundsätzlich mit denjenigen des Warmblüters übereinstimmen, können wir von ihnen ebensowenig eine vollstän­ dige Erklärung der Milzbrandresistenz des Frosches erhoffen, als wir das gegenüber andern Erregern im Bereich der Warmblüter vermögen. Aus diesem Grund haben wir von vornherein auf die Unter­ suchung von Phagocytose und Bakterizidie beim Frosch verzich­ tet und unser Augenmerk auf das Vorhandensein weiterer F ak­ toren gerichtet. Dabei griffen wir gewissermaßen auf die alle, durch Baumgarten und Petruschky vertretene Assimilationstheo­ rie zurück, die das Gewebe der refraktären Tierarten als ungün­ stigen Nährboden für entsprechende Bazillen ansahen. Jeder • Zitiert nach /?. Paltauf, Agglutination, Hdb. ct. Mikroorg. (Kolle und Wassermann), Bd. II, T. 2, Aufl. 111, 1924. Berlin. am milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch Nährboden beeinflußt die Lebensform und das Wachstum der Bakterien über seine chemischen wie auch physikalischen Eigen­ schaften. W ir haben uns die Frage gestellt, ob die Resistenz­ durchbrechung nicht eine Folge der unter dem Einfluß der Tem­ peratur stattfindenden Veränderung der physikalischen Eigen­ schaften des Froschgewebes sein könnte. Unter den theoretisch mehreren Möglichkeiten haben wir zwei untersucht: 1. Die Wasserstoffionenkonzentration; 2. Die Sauerstoffspannung des Froschblutes bzw. -gewebes. II. Vorversuche über die Beeinflussung der Milzbrandresistenz durch die Temperatur. In allen Experimenten verwendeten wir R. temporaria. Die Frösche w ur­ den vor dem Versucli im Bassin mit fließendem Wasser (12—14° C) gehalten und zwangsmäßig mit Larven von Tenebrio motitor, Meersclnveinchenlebcr oder frei mit Calliphora vomitoria g efüttert6. Für die Versuche wurden die Tiere in Standgläsern mit Wasser gehalten, die mittels elektrischer Tauch­ körper auf die gewünschte Temperatur gebracht wurden. Thermoelektrische Bestimmungen in der Kloake der Frösche zeigten, daß die Temperatur der Tiere 0,5— 1,0° C niedriger war als die Temperatur des Wassers. Die Ver- suchstemperaturen betrugen mehrheitlich 15, 25 und 30° C, einzelne Tiere w ur­ den auch bei 5 und 35° (', gehalten. 25° C waren ohne Einfluß auf die Lebens­ dauer der Frösche, bei 30° C lebten sie nur 2—4 Tage. Zur Infektion verwen­ deten wir einen am Meerschweinchen geprüften Stamm mittlerer Virulenz. Die Infektion erfolgte über den dorsalen Lymphsack, von einer 24 Std. alten Milzbrandkultur ausgehend. Keiner der bei 15 und 25° C gehaltenen Frösche ging an der Infektion zugrunde. Die bei 30° C gehaltenen Tiere gingen nach der Injektion von 30— 40 Millionen Keimen regelmäßig an einer bakteriosko- pisch und kulturell kontrollierten Milzhrandsepsis ein. Die entsprechenden KontroUliere überlebten die infizierten um 12—48 Std, Bei Verwendung klei­ nerer Milzbranddosen kam es vor, daß die Tiere vor Entwicklung des septi­ schen Krankheitsbildes den Wärmetod erlitten. Die Bazillen der verendeten Tiere waren mehrheitlich von Kapseln umgeben, büßten ihre Virulenz für den Warmblüterorganismus nicht ein und wurden für Kaltfrösche nicht pathogen. Ein von uns herausgezüchteter «Kaltstamm» büßte während der Züchtung seine Virulenz für die Warmblüter ein, blieb aber vollkommen apalhogen für die Kallfrösche. 111. Beeinflussung des Blut-pH durch die Temperatur. Diese Arbeitshypothese stützte sich auf die in der Literatur wiederholt anzutreffende Anschauung, daß die Serumbakterizidie durch die Blutalkalität gesteigert werde (v.Fodor. 27; v. Bigler, 1 1 für deren Überlassung wir Herrn Dr. Wiesmann von der J. R. Geigy AG., Basel, zu Dank verpflichtet sind. Te s ar z, Die Ursache der Resistenzdurchbrechung 28; Behring, 29; Gruber und Futaki, 30, u. v. a.). Nach Gräber und Futaki hat die Verminderung der Blutalkalität eine verrin­ gerte Absonderung von Anthrakozidin seitens der Zellelemente zur Folge. Behring bezog die Resistenz der weißen Ratten gegen Milzbrand auf die Tatsache, daß das Rattenblutserum eine be­ trächtlichere Alkalcszenz als das Serum empfänglicher Tiere auf­ weist. v. Fodor und v. Bigler haben in ihren Untersuchungen die milzbrandfeindliche Auswirkung der Blutalkalität in vitro wie auch in vivo bewiesen. Die Möglichkeit, in dieser Richtung weiter­ zukommen, wurde noch durch die Arbeit von Austin, Sunder­ mann und Camack (31) gestützt. Sie haben den Serum-pH von Alligatoren, die bei niedriger und hoher Temperatur gehalten wur­ den, colorimetrisch gemessen und folgende Werte gefunden: Serum-pH bei 9” C 7,72, bei 35° C 7,27. Die Literaturangaben über den pH der Säfte der Frösche sind sehr spärlich. Rohde (32) hat mit einer später als unzuläng­ lich erkannten Methode fü r das Blut von R. esculenta pH-Werte im Bereich von 0,32 bis 7,12 gefunden. Nach Fütterung mit Borax­ säure sanken sie auf pH = 4,2, nach Fütterung mit Natriumkar­ bonat stiegen sie auf pH = 8,7. Barkan, Broemser und Hahn 0 geben für das arterielle Froschblut pH = 7,68. für das venöse pH = 7,51 an. Nach Winterstein (33) bewirkt bei Fröschen die Steigerung der Temperatur ein Sinken des pH im Blute, wogegen Evans gerade das Umgekehrte angibt und fü r 20° C Temperatur­ zunahme einen pH-Anstieg von + 0 ,2 feststellt. Unsere pH-Messungen wurden mit einem Apparat, der nach dem Prinzip der Glaselektrode von Michaelis und des Verstärkungspotentiometers nach Young arbeitet, durchgeführt* 7. Seine Fehlergrenze beträgt ±0,02. Die Frösche wurden 48 Sld. vor dem Versuch bei gewünschter Temperatur gehalten. Die Blutgewinnung unter Luftabschluß stieß anfänglich auf nicht unerheb­ liche Schwierigkeiten, die verständlich werden, wenn man bedenkt, daß unsere Frösche 30—40 g schwer waren und sich das Verhältnis Blut—Körpergewicht innerhalb der Werte I : 20—1 : 15,3 (Welcher *) bewegt. Nach langen Vorver­ suchen haben wir schließlich eine Technik gefunden, die uns jederzeit die Ge­ winnung von 0.5— 1,0 ccm Froschblut unter Luftabschluß ermöglichte. Das Versuchstier wird narkotisiert («Numal» 0,1—0,2 ccm subc.) und fixiert. Mit­ tels eines Thermokauters (Vermeidung des Blutverlustes) eröffnet man die Leibeshöhle, entfernt das Perikard, faßt das schlagende Herz mit einer speziell konstruierten zweilöffligen Pinzette und sticht in die Kammer eine fein aus­ “ Zitiert nach Winlerstein (33). 7 Herrn Prof. Ilossier sei auch an dieser Stelle für das Interesse, das er der Arbeit entgegenbrachte, seine mannigfaltigen Ratschläge und die Überlas­ sung der Apparaturen verbindlichst gedankt. am milzbrandinfizierten Wanmvasserfroscli gezogene, im Innern paraffinicrle, in ihrem Spitzenteil mit Paraffinum liqui­ dum gefüllte Pipette ein. Das Blut wird durch Herzkontraktionen in die hori­ zontal gehaltene Pipette eingepumpt und durch das flüssige Paraffin vor der Berührung mit der Luft (COj-Spannung) geschützt. Nach der Herzpunktion wird das gewonnene Blut sofort in einem Reagensglas flüssigem Paraffin unterschichtel und gründlich mit einem gerinnungshemmenden Pulver (0,002 g Natriumfluorat + 0,001 g Kaliumoxalat auf 1 ccm Blut) vermischt. Der ganze Eingriff wurde in einem Raum vorgenommen, dessen Lufttemperatur derjeni­ gen des Wassers des Versuchsfrosches entsprach. Die pH-Messung erfolgte nicht später als 2 Std. nach der Blutentnahme. Tabelle 1 orientiert über die pH-Werte des den bei den verschiedenen Temperaturen gehaltenen Fröschen entnommenen Blutes. TABELLE I. pH-Werte des Froschblutes. Nr. 0 ° c pH-Werte mildere Werte 1 5° 7.12 7,18 2 7.12 3 7.2a 4 7.22 5 7,14 15° 7,21 6 7.15 7 7.24 8 7,32 7,18 10 30'1 7,26 7,31 11 7,32 7,24 13 7,31 Aus den in Tabelle I wiedergegebenen Daten, die sich in der Richtung der von Evans gefundenen bewegen, ergibt sich die voll­ kommene Haltlosigkeit unserer ersten Arbeitshypothese. Das pH des Froschblutes kann bei der Durchbrechung der Milzbrand­ resistenz im warmen Frosch keine Rolle spielen, weil die parallel mit der Steigerung der Temperatur gehende Erhöhung der Blut­ alkalität nach übereinstimmenden Angaben die Serumbakterizidie nicht vermindert, sondern steigert. VI. Einfluß der Temperatur auf die Oo-Spannung im Gewebe. Unsere zweite Hypothese läßt sich folgendermaßen form u­ lieren: Ist die Milzbrandresistenzdurchbrechung im warmen Frosch ganz oder teilweise durch eine allfällige Erhöhung der Oa- Spannung im Froschgewebe zu erklären? T e s a r z , Die Ursache der Resistenzdurchbrechung Diese Hypothese basiert auf folgenden Vorstellungen. Der Milzbrandbazillus entwickelt sich optimal — wenn auch fakultativ anaerob wachsend — nur bei ungehindertem Luftzutritt. Die Oj- Spannung des Nährbodens hzw. des Froschgewebes muß daher einen bedeutenden Einfluß auf seine Wachstumsenergie ausüben. Der kalte Frosch hat einen sehr langsamen Stoffwechsel. Die Os-Spannung im Gewebe ist dementsprechend wahrscheinlich sehr gering und wohl nicht genügend für eine optimale Entwicklung des Milzbrandbazillus. Die Erhöhung der Temperatur bewirkt nun auch beim Frosch eine, quantitativ der van Hoff sehen Regel entsprechende (Qm0 — 2—3), Steigerung des Stoffwechsels. Der daraus resultierende größere Bedarf des Gewebes an O? kann nur dann gedeckt werden, wenn die Os-Spannung im Gewebe parallel dem Stoffwechsel ansteigt. Dadurch werden aber auch die Wachs­ tumsbedingungen fü r den Milzbrandbazillus wenigstens punkto Os verbessert. Die Erhöhung der Os-Spannung im Gewebe des warmen Frosches könnte deshalb wenigstens teilweise (im Sinne eines das Wachstum des Milzbrandbazillus fördernden Faktors) dazu beitragen, die Milzbrandresistenz des Frosches oberhalb 28° C zu brechen. Wenn auch die experimentelle Bearbeitung dieser Frage­ stellung wegen Mangels an diesbezüglichen Literaturangaben und wegen zurzeit unlösbarer technischer Schwierigkeiten nicht rest­ los befriedigend durchgeführt werden konnte, so fanden wir — wie zu zeigen sein wird — doch zahlreiche Anhaltspunkte, die zugunsten unserer Arbeitshypothese sprechen. Ein erster Versuch der Beweisführung galt der Verfolgung der Vermehrungskurve des Milzbrandbazillus bei verschiedenen Os-Spannungen in vitro. a) Abhängigkeit der Wachstumspotenz des Milzbrandbazillus von der Oi-Spannung in vitro. Diese Unlersuchungsreihe wurde mit dem gleichen Milzhrandslamm durchgeführt, den wir für Infektionsversuche verwendeten. Abgemessene Bouillonmengen wurden mit verschiedenen Mengen der .Milzbrandbazillen (30—500 000) einer 24 Std. allen Bouillonkultur beimpft. Die Reagcnsröhr- chen wurden mit einem Gummizapfen verschlossen, der von einem dünnen Glasröhrchen perforiert war. Das Glasröhrchen wurde an eine Vacuumöl- pumpc angeschlosscn und nach Erstellung des gewünschten Druckes zuge- schmolzen. Um eine Vermehrung der .Milzbrandbazillen während der Zeit des Druckausgleichs zwischen Bouillon und Luftraum zu verhüten, wurden die Röhrchen vorgängig der Bebrütung für 4—6 Std. bei 15° C gehalten. Um den am milzbrandinfizierten Warmwasserfrösch Einfluß der 0 2-Zchrung durch die wachsende Kultur in den gasdicht ab­ geschlossenen Bouillonröhrchen möglichst auszuschallen, sorgten wir für gro­ ßen Luftraum über der Bouillon und bebrüteten die Kulturen nur 8 bis maximal 24 Std. Die Keimzählung führten wir bei jeder Untersuchungsreihe mittels der Plattenmethode doppelt aus. Tabelle II gibt Auskunft über die gewonnenen Resultate. Die Keimzahlen sind in prozentualen Werten aus­ gedrückt; 100% entsprechen der Keimzahl bei freiem Luftzutritt. TABELLE II. Wachstum des Milzbrandbazillus in verschiedener Oj-Spannung. 0 2-Spannung im Rgl. mm Hg 20 10 6 4 2 I I. Reihe — — 10,0 3.2 0,4 0,8 II. Reihe — 31,7 8,3 3,4 1,5 — — 111. Reihe 30,0 10,0 1,7 1,1 IV. Reihe 25,0 8,0 9,0 1,7 0,2 0,1 V. Reihe 70,5 23.8 3,3 1,5 0,3 57,1 VI. Reihe 33,3 13,3 7,5 0,7 0,3 0,1 VII. Reihe 38,0 20,0 11,3 4,0 2,0 1.3 VIII. Reihe 23,8 11,9 8,1 1,9 0,5 0,3 Mittlere Prozcntzahlen 38,1 26,3 16,4 4,1 1,3 0.6 Verhäitniszahlen 1 L5 2,3 9 29 63 Die in der Tabelle angeführten Zahlen zeigen, daß die Ver- mehrungsgesehwindigkeit des Milzbrandbazillus mit sinkender Oi- Spannung tatsächlich abnimmt. Bezeichnen wir sie hei 20 mm Hg mit 1, so ist sie bei 10 mm 1 A mal, bei 6 mm 2,3mal, bei 4 mm 9mal, bei 2 mm 29mal, bei 1 mm Hg 63mal kleiner. Anders aus­ gedrückt, ist die Vermehrungsintensität hei einer Ös-Spannung von 4 mm Hg 7mal, bei 6 mm Hg 27mal, bei 10 mm Hg 42mal, bei 20 mm Hg 63mal so groß wie bei 1 mm Hg. Diese Unterschiede lassen klar erkennen, daß der Einfluß der CD-Spannung auf die Vermehrungsintensität des Milzbrandbazillus relativ groß und un­ sere Hypothese vom Standpunkt der Biologie des Mikroorganismus aus gerechtfertigt ist. Dabei sei erwähnt, daß der durch die Bruttemperatur bedingte Wachstumsunterschied des Milzbrandbazillus bei 25° C (Überleben des Frosches) und bei 30° C (Milzbrandsepsis) als bescheiden an­ zusprechen ist, beträgt er doch nur das 2 A fache (siehe Tabelle VII). Die Analyse der gefundenen Werte gibt uns aber auch Aus­ kunft über das Maß der graduellen Empfindlichkeit des Milz­ brandbazillus für eine Ch-Reduktion. Das läßt sich am besten aus T e s a r z , Die Ursache der Kcsistcnzdurchbrechnng einer graphischen Darstellung (Tabelle III) erkennen. Die Steilheit der Kurve lehrt uns, daß die Empfindlichkeit des Milzbrandbazil­ lus auf die Os-Reduktion bei den absolut kleinen Werten am größten ist, was mit Rücksicht auf die ebenfalls absolut kleinen Werte der Ch-Spannung, mit denen im Froschgewebe zu rech­ nen ist, von erheblicher Bedeutung sein dürfte. Der nächste Schritt in der Beweisführung drängte sich von selbst auf. Jetzt galt es, die Os-Spannung im Gewebe des kalten und des warmen Frosches zu messen und die gewonnenen Resultate mit den Ergebnissen der in vitro durchgeführten Untersuchungen zu vergleichen. Damit wäre der direkte Beweis für das Ausmaß Tab. III. Vermehrungskurve des Milzbrandbazillus. der Richtigkeit unserer Hypothese erbracht. Leider sahen wir uns aus Mangel einer zuverlässigen Methodik und zufolge unüberwind­ licher technischer Schwierigkeiten gezwungen, auf diese direkte Beweisführung, d. h. auf die Messung der Oa-Spannung im Frosch­ gewebe, zu verzichten. Eine Zeitlang hofften wir, den in der Froschlymphe physikalisch gelösten Oa quantitativ bestimmen zu können. Die Ausbeute an Froschlymphe erwies sich aber als so gering, daß die absolut gesehenen minimalen Schwankungen des Oa-Gehaltes durch die methodischen Fehlergrenzen überdeckt werden. Es blieb somit nichts anderes übrig, als die Beweisfüh­ rung auf indirektem Weg zu suchen. Das setzt allerdings den meritorischen Wert unserer Arbeit herab, tritt doch an Stelle des eindeutigen Beweises nur ein mehr oder weniger großer Grad von Wahrscheinlichkeit. am milzbrandinfizicrlen Warmwasserfrosch «1 Der einzige gangbare Weg war die theoretische und experi­ mentelle Analyse des Ch-Transportproblems. W ir haben, und wie die Ergebnisse zeigen, wohl mit Recht, vermutet, daß sich daraus gewichtige Rückschlüsse auf die O2-Versorgung und -Spannung des Froschgewebes ergeben. Von besonderem Nutzen waren für uns dabei die Untersuchungen über das Verhalten des Hämoglo­ bins bei verschiedenen Temperaturen. b) Einfluß der Temperatur auf die Ch-Sättigung des Froschblutes. Schon im Jahre 1878 hatte Paul B e r t8 beobachtet, daß menschliches Blut bei Zimmertemperatur und 15 mm Hg O2- Druck zu 90%, bei Körpertemperatur dagegen nur zu 50% gesät­ tigt war. Barcroft und King (35) (1909) und besonders Brown und Hill (36) (1923) haben eingehende Untersuchungen an W arm ­ blüterhämoglobinlösungen durchgeführt und das Verhalten der Dissoziationskurven in Abhängigkeit von der Temperatur stu­ diert. Dabei hat sich gezeigt, daß die O-Dissoziationskurve mit Steigerung der Temperatur sinkt, verflacht, d. h. die Sättigung des Hämoglobins mit O2 kleiner wird. Hartridge und Roughton (37) haben mit einer sehr eleganten Methode die Geschwindig­ keitskonstanten der Reaktion Hb + O2 ^ HbOi direkt gemessen und haben dabei folgendes feslgeslellt: Die Geschwindigkeitskon­ stante (ki) der Oxydationsphase Hb + Oi — > ■ HbOa ist bedeutend größer als diejenige (k) der Reduktionsphase HbO? — > ■ Hb + O2 . Ihr Verhältnis, also die Gleiehgewichtskonstante (K) der Reaktion Hb -f- O2 ^ Hb02 drückt sich aus: = k 17,5 Weiterhin ist die Reduktionsphase HbOs— Hb -j- O2 im Gegen­ satz zur Oxydationsphase sehr empfindlich für die Bedingungen, unter denen sie stattfindet, und zwar bewirken Steigerungen der H'-Konzentration wie der Temperatur eine Zunahme der Ge­ schwindigkeitskonstante ki. Für eine verdünnte Schafshämoglo­ binlösung besitzt die letztere den hohen Temperaturkoeffizien­ ten 3,8. In gleicher Richtung bewegten sich auch die von Magela und SeliSkar (38) durchgeführten Untersuchungen über das Frosch­ hämoglobin. Sie haben Oa-Dissoziationskurven für Froschhämo- 8 8 Zitiert nach hrown und Hill (36). Te s ar z, Die Ursache der Hcsistcnzdurchbrechung «2 globin bei 15, 25 und 35° C aufgestellt und denselben Einfluß der Temperatur beobachtet. Der auf Grund von «tension of unload- ing» (Os-Druck, bei dem das Hämoglobin zu 50% Ch-gesättigt ist) errechnete Temperaturkoeffizient beträgt 2,5, ist also geringer als derjenige des menschlichen Hämoglobins (Qio = 5,6). Uns sind diese Befunde über die Kinetik des Oxyhämoglobins sehr zugute gekommen. Die Steigerung der Os-Spannung im Ge­ webe des warmen Frosches erfordert zwangsläufig einen größe­ ren Os-Druck im Blut, der seinerseits unter anderem eine größere Dissoziationsfähigkeit des Oxyhämoglobins, als sie im Gefolge einer Temperaturerhöhung tatsächlich zustande kommt, zur Vor­ aussetzung hat. Einem ähnlichen Gedankengang ist Rossier (39) gefolgt, als er die Erfrierungen auf eine Dissoziationshemmung des HbOa und anderer Redoxsysteme zurückführte und damit als Folge einer Anoxämie des Gewebes interpretierte. Lutz (40) und v. Wert (41) haben diesen Gedanken experimentell untermauert. Im Verlauf ihrer Untersuchungen über die Ursache des Kältetodes der W arm­ blüter stellten sie tatsächlich eine mit sinkender Temperatur ein­ hergehende Verminderung der Oxyhänioglobindissoziation fest, die ihrerseits zum Oa-Mangel im Gewebe führte. Der HbOa-Gehalt des Venenblutes der Versuchstiere (Katzen, Kaninchen) stieg bei der Abkühlung von 37° C auf 20° C durch­ schnittlich um 20%. Trotz dieser recht erheblichen Zunahme der Os-Sättigung sinkt nun aber der Os-Druck des Blutes auf so kata­ strophal niedrige Werte, daß sie schlußendlich zur Erstickung der Gewebe führen, welche schon den Beginn der Abkühlung mit er­ höhtem Stoffwechsel und damit gesteigertem Os-Bedarf beant­ worten. Die Kinetik des Oxyhämoglobins spielt also bei Lutz und v. Werz theoretisch und experimentell die gleiche Rolle wie bei uns, mit dem Unterschied, daß unsere Beweisführung die um­ gekehrte Richtung einschlägt. Um die Richtigkeit unserer An­ nahme nachzuweisen, stand uns nur die Möglichkeit offen, das Oxyhämoglobin im Blut des kalten und warmen Frosches zu be­ stimmen. Die Ergebnisse von Magela und Selisknr konnten nicht einfach übernommen werden, weil diese Autoren mit Hämoglo­ binlösungen und nicht mit Vollblut gearbeitet und den Einfluß der Temperatur auf das Froschhämoglobin in vitro und nicht in vivo studiert hatten. am milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch 63 F ür die Bestimmungen des H b 0 2-Gehaltes im Froschblut haben wir die gleiche Blutgewinnungsmethode angewandt wie für die pH-Messungen. Die einzige Modifikation bestand darin, daß wir dem Frosch vor der Eröffnung der Leibeshöhle 0,1 ccm Heparin in die Vena abdominalis injizierten. Wir vermieden dadurch die trotz Paraffinierung bisweilen auftretende Gerinnsel- bildung in der Punktionspipette. An die Blutentnahme wurde die Bestimmung der Oj-Sättigung und der ()»-Kapazität sofort angeschlossen, um die 0 2-Zeh- rung (Morawitz und Warburg haben gezeigt, daß kernhaltige Erythrocyten einen erheblichen 0 2-Verbrauch aufweisen) zu vermeiden. Wir benutzten das leicht abgeänderte Differcnlialmanomeler nach Ilaldane (42), stießen aber bei Befolgung seiner Technik auf zunächst unüberwindlich scheinende Schwierig­ keiten. Beim Durchschüttein mit 4%iger Na*C03-LöSung bildete das Frosch­ blut keine Klümpchen, und nach Zusatz von Ferricyanidlösung verwandelte cs sich in einen dicken Gelee, wodurch natürlich die Ciasbeslimmung verun­ möglicht wurde. Die gleiche Beobachtung wurde auch von andern For­ schern gemacht (für Froschblut von W eiß 0, Barcroft [43] u. a., für Fischblut von Krogh und Leitch [44]). Magela und Scliskar bestimmten das Oxyhämo­ globin im Froschblut mit einem «reversion spectroscope» nach Ilartridge. Da uns dieses Instrument nicht zur Verfügung stand, mußten wir einen andern Ausweg suchen. Nach langen, vergeblichen Bemühungen haben wir festgestellt, daß der stark alkalische pH (11,5—12,0) der oben genannten Lösungen die Geleebildung auslöstc. Wir ersetzten deshalb das Natriumkarbonat durch einen «Borat»-Salzsäure-Puffer vom pH = 9,0, dessen Eignung wir durch wieder­ holte Untersuchungen mit Menschenblut sicherstellten. Beim Durchschütleln mit dieser Pufferlösung blieb das Froschblut flüs­ sig und wurde nach Zusatz von Ferncyanid nicht dickflüssiger als normaler­ weise das Menschenblut. Die Zuverlässigkeit der Methode in Anwendung auf Tab. IV. Oxyhämoglobingehalt des Froschblutes. . = Rohwerle — entsprechende Wahrscheinlichkeitskurve X = korrigierte Werte — entsprechende Wahrscheinlichkeitskurve • Zitiert nach Barcroft (43). T e s a r z , Die Ursache der Resistenzdurchbrechung das Froschblut geht daraus hervor, daß Parallelunlersuchungen mit der van .S/yA'cschen Apparatur, die Herr Prof. Rossier für uns ausführte, Abweichun­ gen von nicht mehr als 2% ergaben. Tabelle IV orientiert über den Oxy- hämoglobingehalt des den bei den verschiedenen Temperaturen gehaltenen Fröschen entnommenen Blutes. Die Interpretation dieser Tabelle erfordert eine kurze Erläu­ terung. Mit der gasometrischen Methode nach Haldane-Barcroft bestimmt man bei jeder Blutprobe zwei Werte: die zu vollstän­ diger Sättigung fehlende O-Menge (B) und die gesamte Os-Kapa- zität (C). Daraus rechnet man die prozentuale Sättigung: r __ n A — C — B = 100 - — Weder die gebrauchte Blutmenge noch die Konstante des Apparates, noch die Korrektur für Barometerdruck und Tempera­ tur tritt in der Rechnung auf. Dagegen verlangen die beim Schüt­ teln des Blutes physikalisch in Lösung gehenden N und Cb eine Gaskorrektur, denn das physikalisch gelöste Gas, dessen Menge vom Partialdruck und der Temperatur des Gases abhängt, mit dem das Blut zuvor im Spannungsgleichgewicht stand, bedingt, daß der ermittelte Wert des an das Hb chemisch gebundenen 0= nicht dem effektiven Wert entspricht. Da die Bestimmungen der Os-Sättigung des Froschblutes durchwegs bei Zimmertemperatur (14— 16° C) vorgenommen wurden, muß die Gaskorrektur um so beträchtlicher sein, je mehr die Froschtemperatur von der Unler- suchungstemperatur abweicht. Als Adsorptionskoeffizienten der Gase bei verschiedenen Temperaturen nahmen wir Werte, wie sie für das menschliche Blutplasma bekannt sind. Die N-Korrektur ließ sich glatt errechnen, dagegen konnte die Cb-Korrektur nicht einwandfrei ermittelt werden. Es fehlte dazu eine wesentliche Unterlage, nämlich die Kenntnis des Cb-Partialdruckes im Frosch­ blut. Dieser kann nur an Hand der Cb-Dissoziationskurven des Froschgesamtblutes bei verschiedenen Temperaturen erhoben werden. Da solche bis jetzt nicht existieren und deren Aufstellung zu viel Zeit in Anspruch genommen hätte, haben wir den theore­ tischen Wert fü r Cb-Druck im Froschblut mit \% Ata angenom­ men (beim Menschen im venösen Blut pCb = 5—6 Ata). Dieser uns aufgezwungene Fehler in der Berechnung der Cb-Korrektur verändert aber das Ergebnis der Os-Sättigung um nicht mehr als 1%. Wenn deshalb die ausgezogene Kurve in Tabelle IV für die höheren Temperaturen sicher zu niedere Werte angibt, so verbin­ det die unterbrochene Linie wahrscheinlich etwas zu hohe Werte. am mUzbrandinfizierten Warmwasserfrosch Das ändert nichts an der prinzipiellen und aus der Tabelle leicht ersichtlichen Tatsache, daß die Oa-Sättigung des Frosch­ hämoglobins, gemessen im Herzblut, mit Steigerung der Tempe­ ratur des Tieres progressiv abnimmt. Sie beträgt im Durchschnitt bei 15° C bis 34,1%, bei 25° C bis 22.5%, bei 30° C bis 18,2%, bei 35° C bis 14,3%, d. h. mit andern Worten, daß die Oa-Dissozia- tionsfähigkeit des Froschhämoglobins in vivo parallel mit Zu­ nahme der Temperatur ansteigt. Die Folge davon ist eine relative wie auch absolute Zunahme der physikalisch gelösten Oa-Menge, was eine Erhöhung des Oa-Partialdruckes im Froschblutplasma zur Folge hat. Obwohl es also auf den ersten Blick scheinen könnte, daß der 35°-C-Frosch mit seinem 14.3%igen Oxyhämoglobingehalt eine Tab. V. Dissozialions kurven des Froschhämo- glohins (nach Mac ela und SeliSkar) und mittl. % Oa-Sättigung. niedrigere Oa-Spannung im Plasma aufweisen müsse als der Zim- mertemperaturfrosch mit einer Oa-Sättigung von 34,1%, haben wir in Wirklichkeit, als Folge der temperaturbedingten Änderung der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion Hb + Oa ^ HbOa, trotz der Abnahme der Oa-Sättigung mit einer Steigerung des Oa- Partialdruckes im Plasma zu rechnen. Die Richtigkeit unserer Überlegung beweist Tabelle V. Auf dieser sind die von Magela und SeliSkar gefundenen Oa-Dissoziationskurven des Froscbhämoglo- bins abgebildet und unsere Ergebnisse (mittlere prozentuale Oa- Sättigung) eingezeichnet. Tabelle V zeigt: Der Oa-Sättigung von 34,1% bei 15° C ent­ spricht pOa = 3,3 mm Hg, derjenigen von 22,5% bei 25° C ent­ spricht pOa = 4,6 mm Hg, während eine solche von 14,3% bei 35° C ihren pOa-Gegenwert bei 7,5 mm Hg findet. Da die Magela- SeliSkarsehen Kurven nun an Hämoglobinlösungen und nicht am Gesamtblut ermittelt wurden, können die obengenannten Werte nicht als absolut bezeichnet werden. Es bleibt aber, wie vermu­ tet, die Tatsache bestehen, daß trotz der Senkung der Oa-Sätti- Pathologie und Bakteriologie, Vol. X. Fase. 1 (1947) 6 66 Tc s ar z, Die Ursache der Rcsislenzdurchbrechung gung der Os-Partialdruck im Froschblut mit steigender Tempera­ tu r zunimmt. Ähnliche Feststellung haben Barcroft und King auch am menschlichen Blut gemacht. So entspricht z. B. einer O - Sättigung von 90% bei 14° und 50% hei 38° pCh von 5 mm und 21 m m H g oder einer Sättigung von 80% bei 14° und 64% bei 32° pOa von 3,5 mm und 17 mm Hg. Diese Erscheinung geht wohl sicher auf eine Änderung der Gleichgewichtskonstante für die Reaktion Hb + O ^ IlbCh zurück, woraus eine größere Menge physikalisch gelösten ()■ -■ resultiert. Zugunsten dieser Auf­ fassung spricht auch die Beobachtung von J. Henderson (45) und seinen Mitarbeitern. Sie untersuchten das Blut einer Schildkröte (Chelydra serpentina) bei 20° C und 37,5° C in vitro und fanden als respektive Werte: Freier Cb Vol.% 0,22 (pO» = 57.0 mm Hg) und 0,32 Vol.% (pCh = 130,0 mm Hg). sauer alkalisch Tab. VI. (llarlrUlge and Koughlon.) Abszisse = Wert der Geschwindigkeitskonstanle für die Reduktion. Eine weitere wichtige Tatsache ergibt sich aus Tabelle VI, die zeigt, daß: 1. die Gesell windigkeilskonstante der Reduktion des Oxy­ hämoglobins in saurer Lösung entschieden größer ist als in alkali­ scher und daß 2. dieser Unterschied mit Steigerung der Temperatur immer größer wird. Da nun am Orte der Oxydation des Hämoglobins (beim Frosch außer in der Lunge auch in gewissen Teilen der Haut) die kleinste und an der Stelle der Reduktion des Oxyhämoglobins die größte IT-Konzentration im Blute vorhanden und die Geschwin­ digkeitskonstante der Oxydation des Hämoglobins von pH und Tem peratur beinahe unabhängig ist, muß sich die der Atmung dienende, durch das Hämoglobin Iransportierte und an das Blut­ plasma und Gewebe abgehende Oz-Menge mit Erhöhung der Tem­ peratur vergrößern. Der Nutzeffekt des Hämoglobins steigt mit der Temperatur des Tieres, was sich auf die relative Hemmung des Oz-Druckabfalls im Blut wie auch die bessere 0=-Versorgung des Gewebes gleichermaßen günstig auswirken muß. am milzbrandinfizierten Warmwasserfrosch Daraus ergibt sich zusammenfassend: Der theoretisch postu­ lierte, aus den angeführten Gründen direkt nicht zu beweisende Gedanke einer Zunahme der Ös-Spannung im Gewebe des w ar­ men Frosches findet in der gefundenen Steigerung der Dissozia­ tionsfähigkeit des Froschhämoglobins und der Erhöhung seines Nutzeffektes eine reale Unterlage. Was die — verglichen mit dem Menschen (arteriell 94—97%, venös 65—75%) — relativ niederen Werte des Frosches anbelangt (vgl. Tabelle IV), so erklären sie sich aus der Tatsache, daß das Herzkammerblut des Frosches arteriell-venös gemischt ist und das Froschhämoglobin an sich über eine bedeutend geringere O a - Affinität verfügt als das menschliche. Mngela und SeUSkar schrei­ ben darüber: «For obtaining the same effect in frog Hb, the pressure of O a , compared wilh that sufficient for the 50 p.c. Saturation of human Hb, must be raised at 15° C. 32 times, at 25° C. 12 times, at 35° C. 6 times.» Diese Tatsache reimt sich nicht nur mit unserer theoretischen Annahme, daß im Gewebe des kal­ ten Frosches eine sehr niedrige Oa-Spannung vorhanden sein muß, sondern läßt auch verstehen, daß sich das Froschhämoglo­ bin seiner physiologischen Hauptfunktion, nämlich der Abgabe des O an das Blutplasma und das Gewebe, auch unter ungünsti­ gen Verhältnissen, d. h. auch bei ganz kleinem Oa-Druck (wie das eben bei niedriger Temperatur der Fall ist) entledigen kann. Als weitere Ursache für die ermittelten, relativ kleinen Oa-Sättigungs- werte ist noch die mit starker Atmungsverlangsamung verbundene Narkose zu erwähnen, die wir fü r die Herzpunktion benötigten. Dadurch wurde zweifellos der für die Oa-Sältigung des Blutes und für die Oa-Spannung im Gewebe indirekt so wichtige Einfluß der Kreislauf- und Atmungstätigkeit (wir werden darauf später noch zurückkommen) verschleiert, andererseits konnte aber da­ durch der Hämoglobinfaktor in um so reinerer Form erfaßt werden. Unser nächster und letzter Schritt in der Beweisführung galt der Prüfung der Frage, ob man die Oa-Spannung im Gewebe des Frosches unter Umgehung der Temperaturerhöhung so steigern kann, daß der Frosch milzbrandempfänglich wird. Vom Ergeb­ nis dieses Versuches hing es schließlich ab, ob die Indizienbeweis­ führung, die uns mangels einer Möglichkeit, die Oa-Spannung im Gewebe direkt zu messen, aufgezwungen wurde, brauchbar war oder nicht. T c s a rz , Die Ursache der Resislenzdurehbrechuug c) Künstliche Erhöhung der Ch-Spannung im Froschblut. Wir versuchten dieses Ziel zuerst auf chemischem Wege zu erreichen. Dabei gingen wir von der Tatsache aus, daß der Frosch unter dem Einfluß der erhöhten Temperatur vegetativ umge- stimnit wird und von einer trophotropen in eine ergotrope Ein­ stellung gerät. Diese Umstimmung wird nach Nagel (46) (1935) durch die chemisch-physikalisch bedingte Änderung der Stoff­ wechsellage verursacht, wobei den endokrinen Drüsen eine wich­ tige Vermittlerrolle zuzusprechen ist. Nebst Nebenniere (Adrenalin) scheint besonders die Schild­ drüse hier ein großes Mitspracherecht zu haben [Adler, 47, u. a.). Die sympathikotonische Einstellung des Frosches begünstigt in ­ folge einer Steigerung der Lungenventilation, der Herzfrequenz, des Schlagvolumcns, der Mobilisation der Blutspeicherdepots und Kapillarisation an der Peripherie eine bessere Os-Versorgung des Gewebes. Wir versuchten deshalb die Erhöhung des Os-Druckes im Gewebe, wie sie als Folge der vegetativen Umstimmung durch Erwärmen des Frosches auf 30" C automatisch zustande kommt, bei 25°-C-Frosch durch pharmakodynamische Reizung des sym­ pathischen Systems zu erreichen. Zu diesem Zwecke injizierten wir den Fröschen in den Rückcnlymphsack täglich je 1 ccm Thyroxin «Roche» oder Adrenalin (1 : 1000) oder Thyroxin + Adrenalin,0. Gleichzeitig infizierten wir die Frösche subc.ulan mit Milz- hrandbazillen. Der Erfolg blieb aus. In keinem Fall gelang es uns, eine Milz­ brandsepsis nuszulösen, was verständlich wurde durch die Feststellung, daß weder Thyroxin noch Adrenalin bei 25° C beim Frosch eine deutliche sym­ pathikotonische Wirkung auszuüben vermochten. Auf Grund von Reaktions­ weise, Herz- und Atemfrequenz gewannen wir den Eindruck, daß es kaum mög­ lich sein dürfte, den erwachsenen Frosch mit Thyroxin oder Adrenalin so stark ergotrop zu stimulieren, wie das bei einer Temperatur von ,'!0° C geschieht. Als Beweis für die weitgehende Indifferenz der erwachsenen Frösche mag die Beobachtung dienen, daß ein Frosch bei 25" C eine einmalige Injektion von 5 ccm (!) Thyroxin ohne irgendwelche toxische Erscheinung ertrug. Dieser Mißerfolg veranlaßte uns, eine rein physikalische Methode zu versuchen. Frösche wurden 12 Std. lang bei 25° C vorgewärmt, anschließend in der üblichen Weise infiziert und zusammen mit einem nichtinfizierten Kontrollfrosch in einen Glas­ kolben verbracht. Dieser wurde mittels eines Gummizapfens ver­ schlossen, der durch ein Röhren- und Hahnsystem sowohl an 1 0 10 Für die Überlassung der benötigten Versuchsmengen sind wir der Firma Hoffmann-La Roche AG., Basel, zu Dank verpflichtet. am milzbrandinfizicrten Warmwasserfrosch eine Os-Bombe wie an eine Vakuumpumpe Anschluß finden konnte. Die Luft wurde evakuiert und durch reinen O» ersetzt. Der Anhäufung von COs im Glaskolben wirkten wir durch Auf­ hängen eines Behälters mit Natronkalk und oftmaliges Durchspü- len des Kolbens mit reinem O2 entgegen. Die Zimmertemperatur betrug durchschnittlich 25° C. Der Sinn dieses Versuches ist klar. Von der fünffachen Stei­ gerung des Ch-Partialdruckes erwarteten wir nebst einer größeren Ös-Sättigung des Hämoglobins auch eine Zunahme von physika­ lisch gelöstem O» im Blutplasma und dadurch eine Erhöhung der Os-Spannung im Gewehe. Wird die Resistenz des Frosches bei 25° C hauptsächlich durch einen fü r die ungehinderte Entwick­ lung des Milzbrandbazillus noch zu niedrigen Ch-Druck im Ge­ webe gewährleistet, so sollte die künstliche Erhöhung desselben den Weg fü r die Infektion freilegen. Die Versuchsergebnisse ent­ sprachen unsern Überlegungen. Die mit Milzbrand infizierten Oa-Frösche zeigten nach 6—10 Std. ein starkes entzündliches ödem an der Impfstelle (Rückenlymphsack) und gingen nach 50—60 Std. ein. Bei allen konnte eine eindeutige Milzbrandsepsis baktcrioskopisch und kulturell fcstgestellt werden. Milzbrand­ bazillen waren in allen Organen in großer Menge mikroskopisch nachzuweisen. Sie besaßen meistens Kapseln, lagen, praktisch genommen, fast alle extrazellulär, waren gut färbbar und mit Aus­ nahme derjenigen aus der Leber, die gelegentlich leichte Degene- rationserscheinungen zeigten, fast immer von normaler Form. Die Kontrolliere starben durchschnittlich 48 Std. später, offenbar als Folge der toxischen Einwirkung des reinen Sauerstoffes. Der Zufall wollte es, daß die Mehrzahl der milzbrandigen Frösche nachts gestorben ist. Um dem Einwand einer postmor­ talen Invasion zu begegnen, spritzten wir einigen toten Fröschen eine doppelt so große Milzbranddosis wie den lebendigen ein (2 ccm einer 24stdg. Bouillonkultur) und steckten sie l>ei 25° C in reine Oa-Atmosphäre. Die nach 24 Std. durchgeführte Sektion er­ gab, daß Milzbrandbazillen vom Rückenlymphsack her nur teil­ weise die Rückenmuskulatur und naheliegende Lungenpartien durchwandert hatten, währenddem Herzblut. Leber und Milz bak- terioskopisch und kulturell frei von Bazillen waren. Da unsere Versuchsfrösche maximal 12 Std. nach dem Tod zur Sektion kamen, ist diese «Pathogenese» der Milzbrandsepsis sicher aus­ zuschließen. T e s a r z , Die Ursache der Resislenzdurchhrechun Die Befunde an den in reiner Oa-Atraosphäre und einer Tem­ peratur von 30" C gehaltenen Milzbrandfröschen sprachen eben­ falls für die Bedeutung der O-Spannung. Entsprechend unseren Erwartungen nahm die Milzbrandsepsis unter diesen Bedingungen einen foudroyanten Verlauf. Während bei den bei 30° C gehalte­ nen Fröschen die Milzbrandbazillen kaum vor 30 Std. nach der Impfung im Blut erschienen, erlagen die Tiere in reiner Oa-Atmo­ sphäre der Infektion schon nach 12— 16 Std., wobei die Organe geradezu von Milzbrandbazillen strotzten. In einer dritten Serie versuchten wir die Temperatur auf 20" C hinunterzudrücken. Dabei verhielten sich die Tiere nun nicht nur gegenüber der Infektion, sondern auch gegenüber der reinen Os-Atmosphäre — sie wurde wochenlang schadlos ertra­ gen — vollkommen refraktär. Auf Grund der früheren Überlegun­ gen und Versuchsergebnisse lag es nahe, die Resistenzdurchbrc- chung über eine weitere Steigerung des Oa-Druckes zu versuchen. Dabei zeigte sich aber, daß selbst eine Druckerhöhung auf 3 Ata, welche die Frösche durchschnittlich 72 Std. überlebten, allein und in Kombination mit Adrenalin nicht imstande war, die Infektion zum Haften zu bringen. Angesichts dieser Sachlage stellte sich die Frage nach der Vermehrungsintensität der Milzbrandkeime bei 20° C, d. h. es mußte untersucht werden, inwieweit die Resistenz des Frosches nicht einfach die Folge einer temperaturbedingten Entwicklungs­ hemmung der Milzbrandbazillen war. Dabei ergab sich (siehe Tabelle VII) die überraschende Tatsache, daß sich der Milzbrand­ bazillus bei 20° C 70 OOOmal langsamer vermehrt als bei 30° C, wogegen die entsprechende Reduktion bei einer Temperaturab­ nahme von 30 auf 25° C nur 2 'A beträgt. Der Milzbrandbazillus findet sich also bei einer Temperatur von 20" C so weit von sei­ nem Temperaturoptimum entfernt, daß die an sich wohl schwa­ chen natürlichen Abwehrkräfte des Froschkörpers genügen, um seine Entwicklung überhaupt zu verhindern. Daß angesichts die­ ser Vita minor, in der sich der Milzbrandbazillus befindet, eine unter andern Verhältnissen wichtige Ch-Zufuhr nicht ausreicht, um seine Ix-bensbedingungen als Voraussetzung zur erfolgreichen Infektion zu verbessern, erscheint wohl verständlich. Auf Grund dieser Versuchsergebnisse kommen wir also zu folgender Auffassung über die Ursachen der Milzbrandresistenz des Kaltwasserfrosches. An der Milzbrandresistenz des kalten Fro­ sches sind mindestens drei Faktoren beteiligt: am milzbrandinfizicrlen Warnrwasserfrosch 71 1. Temperaturoptimum des Bazillus, 2. Os-Spanmmg des Gewebes, 3. Zell- und Säftebakterizidie, wobei je nach der Temperatur das Hauptgewicht bei der ersten oder zweiten Komponente liegt. Die Erhöhung der Temperatur auf 25° C schaltet praktisch den hemmenden Einfluß der niedri­ gen Temperatur aus und verringert aller den des relativ niedrigen Oa-Druckes offenbar nur ungenügend. Deswegen kommt es wohl TABELLE VII. Einfluß der Temperatur auf das Wachstum des Milzbrandbaziltus. Temp. Keimzahl in Mill./l ccm Mittlere Keimzahl 0 h. 24 h. ca 0,0003 01 57 Millionen 25° C . 0,0003 06 . 0,0005 52 „ 0,0005 49 30« C . . 0,0005 200 137 Millionen , 0,0005 120 , 0,0005 . 0,0005 98 20° C » 0,0001 0,00075 915 „ 0,0001 0,00112 „ 0,0001 0,00082 „ 0,0001 0,00097 30° C . 0,0001 51 68 Millionen „ 0,0001 89 „ 0.0001 „ 0.0001 64 zu einer stärkeren Vermehrung der Milzbrandbazillen, die aber wahrscheinlich dank der vermehrten Leukocytenaktivität (Nuttal, Kodama) doch noch vernichtet werden. Beseitigt man aber auf künstlichem Wege («Sauerstoff-Frösche») auch die hemmende Wirkung der fü r den Bazillus mangelhaften Oa-Versorgung, so bricht die Infektion durch. Dasselbe, d. h. die Erhöhung der Oa- Spannung im Gewebe bis zu Werten, die dem Oa-Optimum der Milzbrandbazillen nahekommen, wird sehr wahrscheinlich auch durch die Steigerung der Temperatur auf 30° C erreicht. Es fallen also bei 30° C beide das Wachstum des Milzbrandbazillus hem ­ menden Faktoren (Temperatur und niedriger Oa-Druck im Ge­ webe) weg, und die — wenn auch an sich nicht sehr bedeutenden 72 T e s a r z , Die Ursache der Resistenzdurchbrechung natürlichen — Schutzkräfte des Froschkörpers erliegen dem da­ durch verstärkten Ansturm der Bazillen. Tabelle VIII stellt die Ergebnisse der in diesem Kapitel beschriebenen Versuche kurz zusammen. TABELLE VIII. Sauerstoff Temp. Unter normalen Adrenalin Thyroxin Adrenalin 1 Atm. 3 Atm. 3 Atm. Umständen + Thyroxin + Adr. 20» 25° f nach 50-00 Std. 300 f nach t nach 28-48 Std. 12 16 Std. — = keine Milzbranderkrankung; f = Tod und Milzbrandsepsis. Diskussion. Gleich zu Beginn der Besprechung unserer Versuchsergeb­ nisse wollen wir die Tatsache festhalten, daß die Resistenzdurch­ brechung des milzbrandinfizierten Warmwasserfrosches, entgegen der Auffassung einiger älterer Autoren (Lubarsch, Nuttal, Sana- relli), als ein echter Infektionsvorgang aufzufassen ist, trotzdem auch der nicht-infizierle Frosch bei Temperaturen über 28° C nach einer gewissen Zeit (jedoch immer 12— 48 Std. später als der milzbrandinfizierte) verendet. Welcher Natur die das nicht-in- fizierte Tier tötende Temperaturschädigung ist, haben wir nicht untersucht. Unsere erste Arbeitshypothese zur Erklärung der Resistenz­ durchbrechung erwies sich als falsch. Die mit Steigerung der Tem­ peratur stattfindende Abnahme der IT-Konzentration ließ die An­ nahme einer immunbiologischen pH-Schädigung des Froschblutes nicht aufrechterhalten. Dennoch erweisen sich unsere pH-Mes­ sungen vom biologischen Standpunkt aus interessant. Sie beweisen, daß die Konzentration des frei im Blutplasma gelösten COa umge­ kehrt proportional der Temperatur ist, eine Erscheinung, die auch von von Werz anläßlich von Abkühlungsversuchen an Kat­ zen und Kaninchen beobachtet wurde. Dem kalten Frosch kommt der große COa-Druck im Plasma zugute, weil der erhöhte pH die zufolge der niedrigen Temperatur geringe Dissoziationsfähig­ keit des Oxyhämoglobins begünstigt. Hier finden sich sogar An­ knüpfungspunkte an die alte Theorie von Petrm chky, der, sich auf die Fränkelsche Beobachtung der milzbrandfeindlichen W ir­ kung der Kohlensäure stützend, diese als einen ins Gewicht fal­ am lnilzbrandinfizicrten Warmwasserfrosch lenden Faktor fü r die Milzbrandresistenz betrachtete. Petruschky erklärte denn auch die Entwicklung der Milzbrandbazillen im er­ wärmten Frosch sowie ihre Vermehrung im hängenden Frosch- lymphtropfen — in vivo erfolgte in der Lymphe kein Wachs­ tum — mit der verminderten COs-Spannung. Seine Versuche, den Einfluß des COs im lebenden Froschkörper auszuschalten (Aus­ treibung mit stärkeren Säuren oder Bindung mit Alkalien), blieben allerdings resultallos. Es gelang ihm nur, in bei Zimmertemperatur gehaltenen Fröschen durch Vorimpfung mit Milchsäurebazillen oder Barythydratbehandlung ein kümmerliches Auswachsen der Milzbrandsporen zu beobachten. Die Petruschkysche Hypothese wurde nachher nie weiter nachgeprüft; detaillierte Angaben über den milzbrandfeindlichen Einfluß der Kohlensäure und die Werte der CCh-Spannung im Froschgewebe sind uns nicht bekannt geworden. Da aber die Os-Spannung im Gewebe mit steigender Temperatur wächst und der CCh-Druck abnimmt, ist cs trotz der in vitro nachgewiesenen Bedeutung des Oj für die optimale Entwicklung der Milzbrand­ bazillen nicht ausgeschlossen, daß die infektionsfördernde W ir­ kung des O2 durch die COa-Verarmung noch verstärkt wird. Die zweite Arbeitshypothese stieß auf die von uns nicht zu behebende Schwierigkeit der direkten pOa-Messung im Gewebe, so daß wir uns mit einer indirekten Beweisführung — Bestim­ mungen des Oxyhämoglobingehaltes im Blut bei verschiedenen Temperaturen — zufrieden geben mußten. Wir fanden, daß die Oa- Dissozialionsfähigkeit und der Nutzeffekt des Froschoxyhämo­ globins in vivo mit Zunahme der Tiertemperatur größer wird. Dies spricht zugunsten der Auffassung, daß die Oa-Spannung im Gewebe des Frosches mit der Temperatur ansteigt. In dieser An­ nahme wurden wir durch Vergleiche der Verhältnisse bei W arm ­ blütern und theoretische Überlegungen bestärkt. Ehrlich 11 glaubte anhand seiner Versuche, daß die Oa-Spannung im Gewebe gleich null sei. Dies erwies sich später, wenigstens was die Warmblüter betrifft, als ein Irrtum . So hat Kroyh 12 z. B. festgestellt, daß pO= im frischen Urin 35 mm Hg beträgt. Verzär (48) fand für die Spei­ cheldrüsen 44 mm Hg und in willkürlichen Muskeln ca. 20 mm Hg pOa. Campbell (49) hat bei Kaninchen und Katzen den O2 - Druck im unter die Haut und in die Abdominalhöhle injizierten Gas gemessen und als Resultat von ungefähr 300 Bestimmungen 11 Zitiert nach J. A. Campbell (49). 15 Zitiert nach J. A. Campbell (49). T e s a r z , Die Ursache der Rcsislenzdurchbrechung gefunden, daß die Ch-Spannung im Unterhautgewebe 20—30 mm Ilg, in der Abdominalhöhle ca. 30—40 mm Hg beträgt. Den Un­ terschied der Werte führt er auf die bessere Durchblutung der Bauchorgane zurück. W ir sehen also, daß pO> im Gewebe der W armblüter einen Bruchteil, nämlich Vs bis Vs der normalen Luftsauerstoffspannung darstellt und demnach für die Entwick­ lung des Milzbrandbazillus bereits unter dem Optimum liegt. Für die Vermehrung des Milzbrandbazillus durchaus ungenügend dürfte der p O im Gewebe der Kaltblüter werden, das wahrschein­ lich nur noch einen minimalen Os-Partialdruck aufweist. Diese Erkenntnis ergibt sich aus einer Analyse der Faktoren, welche für den pOs im Gewebe bestimmend wirken. Das ist in erster Linie der pOs in den Kapillaren, der seinerseits von folgenden Faktoren abhängig ist. 1. Os-Partialdruck in der Lungenalveole (Art der Lungenventi­ lation) . 2. Os-Kapazität des Blutes: a) Eindickung des Blutes durch Wasseraufnahme vom Ge­ webe. b) Kontraktion der Milz. c) Zunahme des Färbe-Index. 3. Das Blutvolumen, welches in der Zeiteinheit die Gewebsein- heit durchströmt: a) Pulsfrequenz. b) Schlagvolumen des Herzens. c) Änderung im Vasomotorentonus. d) Kapillarisation des Gewebes. 4. Koeffizient der Utilisation des Hämoglobins: a) Artbedingte, spezifische Ch-Affinität. b) Temperaturbedingte O-1 -Dissoziationsfähigkeit. 5. Diffusionskoeffizient des Oj: a) Lungenalveole — > Kapillarblut in der Lunge. b) Kapillarblut an der Peripherie — > das Gewebe. Im Lichte dieser Erwägungen rückt das Problem der Os- Spannung im Gewebe des kalten und erwärmten Frosches unserem Verständnis näher. Der kalte Frosch (z. B. 10° C) ist ausgespro­ chen trophotrop eingestellt. E r ist träge und langsam in seiner am milzbrandinfizierlen Warmwasserfrosch Reaktionsweise, sehr wenig beweglich, Pupille klein, schlitzförmig. In geduckter Haltung verweilt er meistens unter dem Wasser­ spiegel. Dementsprechend ist seine Atemfrequenz praktisch gleich null. Herzschlag 25—30/min. Entsprechend dieser vagotonischen Einstellung und dem langsamen Stoffwechsel ist die Os-Spannung im Gewebe des kalten Frosches sicherlich ganz niedrig, worauf auch unsere Oxyhämoglobinmessungen hinweisen. Auch Brown und Hill trugen dieser Erscheinung Rechnung und glauben, daß der Temperaturrückgang bei Kaltblütern mit einer Senkung des Os-Druckes auf minimale Werte verbunden ist, was sich in äußer­ ster Verlangsamung der regenerativen Prozesse in den Muskeln widerspiegeln soll. Der warme Frosch weist eklatante Unterschiede auf. Er ist eindeutig sympathikotonisch eingestellt. Hoch aufgerichtet, ge­ spannt, von lebhafter Reaktionsweise, Pupille weit aufgerissen. Atemfrequenz 15—20/min., Herzschlag 55—65/min. Die Os-Kapa- zität des Blutes nimmt mit der Temperatur zu; auf 100 ccm Blut berechnet, beträgt sie l>ei 15° C — 14,07, 25° G — 14,81, 35° C — 15.78. Wir dürfen annehmen, daß sich auch Vasomotorentonus und Kapillarisation des Gewebes im Sinne der besseren Oa-Ver- sorgung ändern. Dazu kommt nun noch der überaus wichtige Hämoglobinfaktor. Unter diesen Umständen sind wir zur Fest­ stellung berechtigt, daß gemäß der sympathikotonischen Lage und größerer Dissoziationsfähigkeit sowie erhöhtem Nutzeffekt des Hämoglobins der Os-Partialdruck im Gewebe des warmen Frosches parallel der Stoffwechselzunahme eine erhebliche Steigerung e r­ fährt. Einen Begriff von der Größe dieser Steigerung gibt uns die Vergleichung der Lungenventilation. Der kalte Frosch, der meistens unter dem Wasserspiegel verweilt, besitzt natürlich einen minimalen Os-Partialdruck in der Lunge, welcher jedoch beim warmen Frosch mit seinen 15—20 Atembewegungen/min., relativ gesehen, eine sehr große Zunahme aufweisen muß. Oh die An­ passungsvorgänge, die eine bessere Oi-Versorgung des Gewebes sicherstellen, mit der Steigerung des Os-Bedarfs der Zellen bei höheren Temperaturen Schritt halten, ist eine andere Frage. Je­ denfalls erlauben uns die durchgeführten Untersuchungen und theoretischen Erwägungen, folgende Schlüsse zu ziehen: Vergleicht man die obengenannten, für den pOs in Kapillaren und Os-Versorgung des Gewebes wichtigen Faktoren beim W arm ­ blüter und kalten Frosch, so kommt man zur Überzeugung, daß der pOs im Gewebe des Kaltfrosches beträchtlich niedriger sein 76 Te s ar z, Die Ursache der Kesisteuzdurchbrechung muß als im Warmblütergewebe. Da im letzten der pCb durch­ schnittlich 20—30 mm Hg hoch ist, dürfen wir annehmen, daß er im Gewebe des Kaltfrosches auf Werte herabsinkt, die sich um den Nullpunkt bewegen. Gaarder (50) gibt an, daß der Ch-Druck eines Teiles des Karpfengewebes unter normalen Verhältnissen gleich null ist. Die Erwärmung des Frosches auf 30“ C bewirkt durch Änderung der Gleichgewichtskonstante der Reaktion Hb + Oj ^ HbOs sowie Umstellung der vegetativen Lage und des Stoff­ wechsels eine erhebliche Steigerung des Os-Druckes im Gewebe, die wahrscheinlich mehrere mm Hg beträgt. Diese quantitativen Feststellungen sind sehr bedeutsam für die Beurteilung der punkto Milzbrandresistenz und Milzbrand­ empfänglichkeit wichtigen immunbiologischen Bedeutung für die 0 - Spannung im Froschgewebe. Unsere Versuche über die Abhän­ gigkeit der Wachstumspotenz des Milzbrandbazillus von der Os- Spannung in vitro lassen klar erkennen, daß die Vermehrungs­ intensität des Milzbrandbazillus durch den O-Mangel deutlich, und zwar besonders stark bei den absolut kleinen Werten (pOs = 1— 6 mm Hg) gehemmt wird. Gegenüber der Vermehrungsinten­ sität bei freiem Luftzutritt ist die Wachstumspotenz bei pOs = 1 mm Hg lGGinal kleiner, wogegen bei p O = 10 mm Hg nur um das öfache. bei pO» = 20 mm Hg sogar nur um das 2,6fache ab­ nimmt. Da wir an Hand obiger Erwägungen im Gewebe des kalten Frosches wahrscheinlich mit einer minimalen O -Spannung rech­ nen dürfen, ist anzunehmen, daß die Milzbrandresistenz des kal­ ten Frosches in hohem Maße durch die absolut kleine Os-Span- nung im Gewebe bedingt wird. Demgegenüber ist die Erwärmung des kalten Frosches auf 30° C von einer solchen Steigerung des Oa-Druckes begleitet, daß sich hieraus für das Wachstum des Milzbrandbazillus keine Hinderung mehr ergibt. Nun haben aber weitere Untersuchungen gezeigt, daß die Milzbrandresistenz des 20°-C-Frosches mittels der bei 25° C wirk­ samen Os-Spannung nicht durchbrochen werden konnte. Dieser Mißerfolg, der auf den ersten Blick gegen unsere Hypothese spricht, wurde durch Untersuchung über den Einfluß der Tem­ peratur auf das W achstum des Milzbrandbazillus aufgeklärt. Es zeigte sich nämlich, daß die Vermehrungsintensität des Milzbrand­ bazillus bei einer Temperatur von 20" C 70 OOOmal geringer als bei 30° C. d. h. praktisch auf ein Minimum reduziert ist. An der Milzbrandresistenz des Frosches bei 20° C und darunter sind so­ am milzbrandinfizierlen Warmwasserfrosch mit theoretisch 2 Faktoren beteiligt, praktisch wird jedoch der an sich entwicklungshemmende Einfluß der ungenügenden Ch- Spannung im Gewebe durch die Abweichung vom Temperatur­ optimum der Milzbrandbazillen vollkommen überdeckt. Mit dem Anstieg der Tiertemperatur von 20° C auf 25° C wird die temperaturbedingte Wachstumshemmung des Milzbrand­ bazillus überwunden — die Vermehrungsintensität des Erregers bei 25° C ist nur rund 2 'Amal kleiner als bei 30° C. Jetzt kommt aber noch ungenügende (L-Spannung zur Geltung und übernimmt gewissermaßen die Führung im Kampfe um die Erhaltung der Milzbrandresistenz des Frosches. Im Gegensatz zum unüberwind­ lichen Hindernis der Temperatur — die Züchtung eines virulenten Milzbrand-Kaltstammes gelang uns nicht — konnte das Hindernis des für den Milzbrandbazillus ungenügenden CL-Druckes durch bessere ÜJ-Zufuhr überwunden werden. Dieser Vorgang stellt sich hei der Erhöhung der Temperatur auf 30° C automatisch ein. Jetzt vermögen die natürlichen Abwehrkräfte des Froschorganis­ mus dem verstärkten Ansturm der Milzbrandbazillen nicht mehr standzuhalten. Die Milzbrandresistenz des Frosches wird durch­ brochen. Steigert man hei 30“ C zusätzlich den pOs, so wird der Frosch, entgegen unserer Hypothese, noch früher septisch. Im Lichte dieser Beobachtungen scheint die natürliche Zell- und Säftebakterizidie des Frosches nur in minimaler Weise an der Milzbrandresistenz beteiligt zu sein. Dagegen ergibt sich aus diesen Untersuchungen, wie sehr rein physiologische Gesichts­ punkte hei der Beurteilung von Gast-Wirt-Beziehungen zu berück­ sichtigen sind. Zusammenfassung, An der Milzbrandresistenz des kalten Frosches sind die nach­ stehenden. in der Reihenfolge ihrer Wertigkeit aufgeführten F ak­ toren beteiligt: 1. Temperatur, deren bakteriostatischer Einfluß sich auch in vitro erfassen läßt, und der bei 20° C und darunter nicht über­ brückt werden konnte. 2. O2 -Druck im Froschgewebe, dessen entwicklungshem­ mende Wirkung ab 25° C durch gesteigerte Ch-Zufuhr behoben werden konnte. 3. Eine bescheidene Zell- und Säftebakterizidie, die nur heim Spielen wenigstens einer der beiden wirksamen Komponenten zur Auswirkung gelangen kann. T rsarz, Die Ursache der Kesistcii/durchbrechnng Résumé. La résistance de la grenouille froide à l'infection charbon­ neuse dépend des facteurs suivants, classés par rang d’impor­ tance : I o La température, dont l’effet bactériostatique peut être mis en évidence même in vitro et s’avère insurmontable à 20° C. et au-dessous. 2° La tension d ’oxygène dans les tissus de la grenouille ; l'effet inhibiteur qu’ils exercent sur la croissance peut être neu­ tralisé à partir de 25° G. par un apport supplémentaire d’0 2. 3° Le pouvoir bactéricide modeste des cellules et des humeurs, qui ne peut toutefois intervenir que lorsque l’une au moins des conditions requises ci-dessus se trouve remplie. Riassunto. Nella resistenza del carbonchio della rana fredda trovasi una partecipazione dei seguenti fattori, messi neU’ordine della loro valenza: 1. ° Della temperatura, il di cui influsso bacteriostatico si puó anche afferrare in vitro e che non si poté sorpassare avendo una temperatura di 20° e meno. 2. ° Della pressione dell’ossigeno nel tessuto della rana. Si poté aboliré l’effetto arrestante lo sviluppo mediante un’afflusso aumentato d’ossigeno a partiré di gradi 25. 3. ° D’una modesta bactericidia di cellule e di sueco, la quale non puó diventare effettiva che in presenza di almeno una delle due componenti effettive. Summary. The resistance of the frog to anthrax is dependent on the following factors: 1. Temperatures below 20° C. exert a bacteriostatic effect as could also be demonstrated in vitro. 2. Low oxygen-pressure in the frog’s tissues. The resistance of the frog to anthrax infection can he eliminated by increased oxygen-pressure at temperatures of 25" C. and higher. 3. A low grade bactericidal property of the tissues and of the blood. Both are eliminated either by increased temperature or by increased oxygen-pressure. am milzbrandint’iziertcn Warm wasser frösch Literatur. 1. Koch, li., Colins Beilr. z. Biol. d. Pfl. 2, 1876, 284. — 2. Gibier, Compt. rend, de l’acad. sc. .94, 1882, 1605. — 3. Pasteur, Joubert et Chamberland. Compt. rend, de l'acad. sc. 87, 1878, 17. — 4. Metschnikoff, E., Virchows Archiv 97, 1884, 502. — 5. Lubarsch, O., Zbl. f. Bakt. Orig. C, 1889, 481. — 6. ließ, C., Virchows Archiv 109, 1887, 365. — 7. Nuttal, G., Zsclir. f. Hyg. 4, 1888, 353. — 8. Petruschky, J ., Zieglers Beilr., 3, 1888, 359; Zschr. f. Ilyg. 7. 1889, 75. — 9. Fahrenholtz, G., Zbl. f. Bakt. Bef. 7, 1890, 199. — 10. Voswin- kel, Fortschr. d. Med. 8, 1890, 10. — 11. Fischei, F., Fortschr. d. Med. 9. 1891, 2. — 12. ¡{ohrschneider, K., Zieglers Beitr. 9, 1891, 515. — 13. Sanarelli, G., Zbl. f. Bakl. Orig. 9, 1891, 467. — 14. Klein und Coxwell, C., Zbl. f. 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Journal

PathobiologyKarger

Published: Jan 1, 1947

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