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Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose I

Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose I Fuat, l i ., A . Studer u n d E . B ö h n i: Schwei/.. Z. T u b e rk . 12y 4 6 9 -4 8 0 , 1955 Aus den Wissenschaftlichen Laboratorien der F. Hoffmann-La Koche & Co. AG, Basel Bewertung der antituberkulösen Wirkung im Mäuseversuch Von B. FUST, A. STUDER und E. BÖHNI 1. Einleitung Grimberg und Schnitzer [1] haben als erste gezeigt, daß dem Isonicotinsäurehydrazid und vielen seiner Derivate eine beträcht­ liche antituberkulöse A ktivität zukommt. Im Anschluß an diese Befunde stellte sich unserer Arbeitsgruppe das Problem, die Wir­ kung des Isoniazids eingehender zu analysieren, aus einer größeren Zahl von aktiven Isoniazidderivaten die Präparate mit optimaler Wirkung auszusuchen und durch das Studium der Beziehungen zwischen K onstitution und A ktivität in dieser Reihe dem Chemiker Hinweise für weitere Synthesen zu geben [2-41- In der vorliegenden Arbeit wird die angewendete biologische Methodik beschrieben. In der Überzeugung, daß Reagensglasversuche keine sicheren Anhaltspunkte für die klinische Brauchbarkeit einer Substanz als Antituberculoticum liefern können, wandten wir uns von Anfang an dem Tierexperiment zu. Grundsätzlich hielten wir uns an die von Fust und Studer [5] beschriebene Methode, die wir im Laufe der Zeit weiter ausbauten und teilweise speziell für die Beurteilung von Abkömmlingen des INH Zuschnitten. Wie andere Prüfer [6-10] wählten wir die weiße Maus als Versuchstier, obschon die künstlich an ihr erzeugbare Tuberkulose in verschiedener Hinsicht, besonders histopatholo- gisch, stark von der Tuberkulose des Menschen, vor allem aber auch derjenigen anderer Tiere abweicht [11, 12]. Die kurze Generations­ dauer, die gute Reproduktionsfähigkeit, die Möglichkeit der Inzucht F u s t et al., C hem o th erap ie d er ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 6 9 mäßigen Grades ohne Gefahr rasch eintretender Degeneration und die relativ bescheidenen Ansprüche in bezug auf Raumbedarf und Wartung bieten Vorteile, welche diese Spezies für die Durchführung großer Reihenversuche besonders geeignet erscheinen lassen. Aus­ schlaggebend aber ist die Tatsache, daß die Tuberkulostatika, die sich am Patienten bewährt haben, in der Regel ihre A ktivität, ob­ schon in wechselndem Maße, auch an der Maus bekunden. Wir kennen bis jetz t nur wenige Stoffe, die im Mäuseexperiment ver­ sagen und am klassischen Versuchstier für die Tuberkulose, am Meerschweinchen, wirksam sind. Zweifellos ist das Meerschweinchen mit seiner Einkeimdisposition für die Tuberkulose das feinere Instrument zum Nachweis antituberkulöser Effekte als die Maus, die nur auf die Infektion mit massiven Dosen von Tuberkelbazillen zu erkranken pflegt. Praktisch ist aber die Gefahr wohl gering, daß ein hoch-wirksamer tuberkulostatischer oder tuberkulozider Stoff' im Mäuseversuch übersehen werden könnte. Für das Studium der Im m unitäts- und Allergieverhältnisse bei der Tuberkulose und anderer Vorgänge, welche die Disposition oder Resistenz des Wirts­ organismus beeinflussen, dürfte dagegen die Maus weniger geeignet sein. Das Mäuseexperiment nimmt daher eine gewisse Mittelstellung zwischen dem Reagensglastest und dem Versuch am Meerschwein­ chen ein, besonders wenn das am m eisten geübte Simultanverfahren benützt wird. Gegenüber den Reagensglastesten hat das Tierexperiment den Vorteil, daß man sich von vorneherein mit der Verträglichkeit bzw. der T oxizität der zu prüfenden Präparate vertraut machen muß. Viele Stoffe, die in vitro aktiv sind, erweisen sich als toxisch, andere büßen in vivo die Wirksamkeit ein. 2. Prüfung a u f Verträglichkeit Wir bestimmen die Toxizität, indem wir Mäusen einmal abge­ stufte Dosen der zu prüfenden Verbindungen als wässerige Lösun­ gen subkutan injizieren oder als Suspension in Gummi arabicum miL der Magensonde verabreichen. Nachdem wir in Vorversuchen den Toxizitätsbereich einer Ver­ bindung einigermaßen abgetastet haben, führen wir mit einer größeren Zahl von Tieren den Hauptversuch aus. Bei der Abstufung der Dosen und der Besetzung der einzelnen Positionen tragen wir den Eigenschaften der Präparate so weit als möglich Rechnung. F u s t e t al., C h em o th erap ie d er ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 0 Präparate, deren tödliche Dosis nahe bei der symptom los verträg­ lichen Dosis liegt, erfordern keinen so großen Einsatz wie Verbin­ dungen, deren Toxizitätsw erte stark streuen. Wir beobachten die Tiere 6 -8 Tage und berechnen dann die Dosis letalis 50% (DL 50) nach unserem eigenen Verfahren in der Weise, daß wir alle Dosen zwischen der Dosis letalis 0-10% (DL 10) und der Dosis letalis 90-100 % (DL 90) benützen. (d, + (L) v2 + (da + d3) (v3 — v,) (d:1 + (1,) (v, — v3) Beispiel DL 50 Präparat Dosis letalis Dosen Verhältnis der gestorbenen 0/ /o zu den eingesetzten Mäusen mg/kg (<9 (V ) d4 = 2250 6 / 6 v4 = 100,0 d3 = 2000 5 / r> v , = 83,4 ds = 1500 2 / 6 V, = 33,3 d ! = 1250 0 / 4 v1 = 0 (1250+1500)-33,3 +-(1500+2000) • (83,4 — 33,3)+(2000 r 2250)-(100 — 83,4) Diese Methode hat den Vorteil, daß man mit beliebigen Zwi­ schendosen und Tierzahlen arbeiten kann; ausnahmsweise haben wir in der allerjüngsten Zeit die DL 90, 50 und 10 am 1. und 10.Tage nach Versuchsbeginn mit der Probit-Methode ermittelt [13]. 3 3. Prüfung a u f antituberkulöse Wirkung a) Dosierung und Applikation der Präparate Für die Tuberkuloseversuche verwenden wir zuerst Tagesdosen von V<_1/s der symptomfrei verträglichen DL 10. Verbindungen, die in dieser Dosierung noch hochwirksam sind, werden anschließend in absteigenden Dosen zur Festlegung des Isoniazidindex (vgl. S. 477) geprüft. Nach unseren Erfahrungen werden Dosen von Vj - '/ j der symptomfrei verträglichen DL 10 nur selten auf die Dauer nicht gut vertragen; sie stellen aber in der Regel die höchstmöglichen Gaben dar, insbesondere wenn die Präparate mit der Magensonde oder subkutan appliziert werden. Dem Futter beigemischt sind bisweilen auch noch wesentlich größere Mengen verträg­ lich. Wir haben die zu prüfenden Verbindungen stets in Futterbiskuits cingcbackcn und wasserlösliche Substanzen zusätzlich noch auf ilire Wirkung hei subkutaner Zufuhr geprüft. Die Verabreichung im Futter sichert automatisch eine ziemlich regelmäßige Aufnahme des Medikaments und vermeidet große Schwankungen des F u s t e t al., C hem o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erkulose 4 7 1 Blut- und Gewebegehaltes, während eine subkutane Injektion pro Tag eher eine rasch abfallende Spitzenkonzentration im Organismus bewirkt. b) Impfmaterial und Infektionsmodus Zur Infektion verwenden wir den global bekannten humanen Tuberkclbazil- lenstamm H3-Rv, den wir 9-11-13 Tage in Original-Dubos-Nährflüssigkeit mit Twecn züchten. Die Kulturen werden unter Zusatz frischer Dubos-Nälirllüssigkeit so lange verdünnt, bis die nephelometrisch gemessene Durchlässigkeit der Suspen­ sion 70% derjenigen der unbeimpften Dubos-Nährflüssigkcit erreicht. Davon spritzen war weißen Inzuchtmäusen, den Nachkommen von Vettern und Basen aus der eigenen Zucht, je 0,5 ein3 intravenös ein. Für die Gewinnung reproduzierbarer Resultate halten wir die Verwendung erbbiologisch einigermaßen einheitlicher Tiere für unerläßlich, weil Mäuse verschiedener Provenienz im allgemeinen auch bezüglich ihrer Tuberkulosedisposition stark differieren [14]. Unsere Mäuse sind in mittlerem Grade ziemlich gleichmäßig für massive Infektionen mit Tuberkel­ bazillen empfänglich. Um allfällig dennoch vorkommende individuelle Schwan­ kungen auszugleichen, setzen wir für jede Dosis eines jeden Präparates 10 Tiere ein. c ) Behandlungsdauer Die Behandlung beginnt am Tage nach der Infektion (Simultancxpcriment). Die Tiere erhalten die zu prüfenden Präparate bis zum Versuchsabschluß. Am 19. Tage töten wir die Mäuse, um den Obduktionsbefund zu erheben und Material für die histologische Untersuchung zu gewinnen. d) Pathologie der experimentellen Tuberkulose der Maus und Bewertung der a u f anti­ tuberkulöse Aktivität untersuchten Substanzen. Nach der intravenösen Injektion von Tuberkelbazillen treten bei der Maus regelmäßig spezifische Veränderungen in der Lunge und in der Leber auf; Milz, Herz und Nieren sind weniger häufig und oft auch in nicht so charakteristischer Art befallen. Die Veränderungen sind zum größten Teil schon von bloßem Auge, besser noch bei 6- bis lfifacher Vergrößerung mit dem Lupenmikroskop oder bei der histologischen Untersuchung erkennbar. Wir erheben daher makroskopische, lupen­ mikroskopische und histologische Befunde. Makroskopisch und lupenmikroskopisch untersuchen wir stets Lunge, Herz, Milz und Leber aller, histologisch nur Lunge und Leber der Hälfte der Versuchs­ und Kontrolltiere. In der Lunge nicht oder erfolglos behandelter Mäuse bilden sich mehr oder minder zahlreiche graue oder gelbliche, leicht eingesunkene, flache oder promi­ nente Herde oder Knötchen verschiedener Größe und Konsistenz, die gelegentlich konfluieren. Seltener kommen ausgedehnte spezifische Herdpneumonien vor. Der Herzmuskel ist hie und da in wechselndem Grade von graublauen Herden oder gelblichen Knötchen verschiedenen Durchmessers durchsetzt. Die Milz reagiert auf die tuberkulöse Infektion meist mit einer allgemeinen Volumen- und Gewichtszunahme, die sehr stark ausgeprägt sein kann. Distinkte weiße oder gelbliche, runde oder in Streifen angeordnete, eingesunkene, flache oder prominente Herde werden nicht so häufig beobachtet. 4 7 2 F u s t e t al., C h em o th erap ie d er experim entellen T u b erk u lo se I Auch die Leber ist nicht selten vergrößert. Manchmal tr itt die Läppchen­ zeichnung stärker hervor. Herdförmige Veränderungen, die von bloßem Auge oder mit dem Lupenmikroskop erfaßbar sind, pflegen nicht konstant vorzukom­ men. Es handelt sich um weiße oder gelbe Knötchen unterschiedlicher Größe und Konsistenz, um unregelmäßig begrenzte, flache gelb- oder braungrüne oder um graurotc, meist punktförmige Herde. Im histologischen Schnitt finden wir hin­ gegen recht regelmäßig spezifische Veränderungen. Die geschilderte Art der Untersuchung verm ittelt uns einen weitgehend vollständigen Gesamteindruck über den Schweregrad der tuberkulösen Erkrankung der Mäuse. Die Wirkung der untersuchten Verbindungen zeigt sich in einer Reduktion oder im Ausbleiben der beschriebenen Veränderungen. Zur zahlenmäßigen Erfassung der Verhältnisse ziehen wir die makroskopisch, lupenmikroskopisch und histologisch nachweisbaren spezifischen Lungenveränderungen, sowie die histologisch erkennbaren tuberkulösen Veränderungen in der Leber heran. Bei der Beurteilung mit unbewaffnetem Auge und bei der Unter­ suchung unter dem Lupenmikroskop unterscheiden wir 4 Schwere­ grade der tuberkulösen Erkrankung der Mäuselunge, wobei wir vor­ wiegend der Zahl, so weit als möglich aber auch der Ausdehnung und der Qualität der Veränderungen Rechnung tragen. 1-2 kleine oder mittelgroße Herde werden mit +, einige Herde mit + + , reich­ lich Herde mit +++ und massenhaft Herde mit ++++ registriert. Wir fassen die Gesamtheit der spezifischen Luugenveränderungen einer Tierserie in einem Gruppenindex zusammen, der den mittleren Schweregrad der tuberkulösen Lungenerkrankung zum Ausdruck bringt. Der absolute Gruppenindex wird errechnet, indem wir die Prozentzahlen der obduzierten Mäuse mit + + _r + mit dem Faktor 4, jene der Mäuse mit +++ mit dem Faktor 3 und jene der Mäuse mit ++ mit dem Faktor 2 multiplizieren. Zu den 3 Produkten addieren wir die einfache Prozentzahl der Mäuse mit + . Wird der Gruppen­ index der Kontrolltiere gleich 100 gesetzt und mit dem Gruppen­ index der behandelten Mäuse verglichen, so können wir den rela­ tiven mittleren Schweregrad (relativer Index) der spezifischen Lungen­ erkrankung bestimmen. Bei jedem Versuch führen wr ir I N H als Standardpräparat in Tagesdosen von 20 mg/kg mit. Der aktuelle Gruppenindex für Isoniazid erlaubt uns jeweilen den direkten Ver­ gleich der untersuchten Verbindungen mit IN H . Zwischen dem makroskopisch festgestellten und dem lupenmikroskopisch ermittel­ ten Gruppenindex besteht naturgemäß nur ein gradueller Unter­ F u s t e t al., C h em otherapie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 3 schied; die Untersuchung m it der Lupe deckt bisweilen noch winzige spezifische Veränderungen auf, die dem unbewaffneten Auge ent­ gehen. Mit beiden Verfahren erfassen wir jedoch nur die Herde an der Lungenoberfläche. Wir halten, wenigstens für Präparate, die eine gewisse A ktivität zeigen, für eine eingehende Beurteilung die histopathologische Untersuchung als notwendig. Bei dieser finden wir Knötchen und spezifische Herdpneumo­ nien. Die Knötchen entstehen durch herdförmige Proliferationen der Alveolarepithelien und setzen sich aus ziemlich großen, hellen Zellen mit schaumigem Protoplasma zusammen. Wir bezeichnen sie als «Epitheloidzellknötchcn». Es handelt sich aber nicht um Epi- theloidzellen im klassischen Sinne, da sie im Gegensatz zu diesen gelegentlich Tuberkelbazillen enthalten. In solchen Knötcheu finden wir außerdem Makrophagen, welche dem Interstitium des verdickten Alveolarsystems entstammen. In den spezifisch pneu­ monischen Bezirken tritt die alveoläre Proliferation ganz zurück. Die Alveolarepithelien desquamieren rasch. Das Alveolargerüst bleibt aber noch lange erhalten. Solche Herde sind stark leukocytär infiltriert und enthalten im Vergleich zu den Knötchen massenhaft Tuberkelbazillen. In ihrer Umgebung liegen nicht selten basophile, homogene, schollige Massen noch unklaren Ursprungs. Nach der Zahl und Ausdehnung der Veränderungen im histologischen Schnitt unterscheiden wir drei Schweregrade 1-3. Der histologische Gesamt­ lungenindex einer Gruppe wird als Durchschnitt der untersuchten 4 -6 Lungen errechnet und stellt die Summe des mittleren Schwere­ grades der tuberkulösen Veränderungen in 1— 3 Paraffinstufen­ schnitten dar. Hierbei werden die proliferativen Knötchen («Epi- thcloidzellknötchen») und die spezifischen Herdpneumonien mit den lndices 1-3 bewertet, wobei der Index für die Herdpneumonien en t­ sprechend ihren tiefgreifenderen geweblichen Veränderungen ver­ doppelt wird. Die Leber tuberkulöser Mäuse zeigt herdförmige Hyperplasien des retikuloendothelialen Systems mit Bildung zahlreicher, diffus über das Gewebe verteilter Knötchen, außerdem eine diffuse Hyper­ plasie der Kupfferschen Sternzellen. Nekrotische Einschmelzung ist hier so selten, daß sie vernachlässigt werden darf. Wir unter­ suchen 1 Paraffinschnitt aus jeder Leber, ermitteln den Schweregrad 1-3 für die herdförmige und getrennt für die diffuse retikuloendo- theliale Hyperplasie und berechnen den Gesamtleberindex einer Gruppe als Mittel der genannten lndices. 4 7 4 F u s t e t al., C h em o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I Die histologisch ge­ wonnenen Zahlen werden wiederum mit den entspre­ chenden Werten bei nicht behandelten und bei mit INH behandelten Mäusen in Beziehung gebracht. An einem Beispiel soll die Ermittlung der ver­ gleichbaren Zahlen erläu­ tert werden. Wir untersu­ chen das Verhalten einer Gruppe von 20 unbehandel­ ten K ontrollieren mit 3 Gruppen von je 10 Ver­ suchsmäusen, von denen je eine 20 mg Isoniazid, 50 mg von Präparat x oder 100 mg von Präparat y pro kg und Tag per os erhalten hat. Histologischer Lungenindex Da wir nur die Lungen und Lebern der Hälfte der Mäuse histologisch zu untersuchen pflegen, ist es wichtig, eine repräsentative Auswahl zu treffen. Diese wird nach dem makrosko­ pischen und lupenmikro­ skopischen Lungenbefund vorgenommen. Die histologische Be­ wertung ergibt folgende Schweregrade der tuberku­ lösen Lungenerkrankung: Makroskopischer Liingeniivlcx F u s t e t al., C hem o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 5 IndiccA für G e sa m tlu n g e n in d c x P r ü p n r a t B e u rte ilu n g «E pitheloid* spezielle Herd* re la tiv * a b s o lu t zellk n ö tch cn » p u e u tn o n ien Maus INH Durchschnitt 0,6 0,13 0,6 + 2 X 0,13 = 0,86 19,1 wirksam von 5 Tieren Maus X Durchschnitt 1,6 0,66 1,6 + 2 x 0,66 = 2,92 64,8 etwas von 5 Tieren wirksam Maus Durchschnitt 2,5 1 2,5 + 2 x 1 = 4 , 5 100 unwirksam von 5 Tieren * K o n tro lle n 1 0 0 % Der t bersicht halber stellen wir die auf verschiedene Weise gewonnenen relativen Lungenindices zusammen: R e la tiv e L un g e n in d ic es in % • P r ä p a r a t B e u rte ilu n g m a k ro sk o p isc h lu p e n m ik ro sk o p isc h h isto lo g isc h INH 22,8 32,6 19,1 wirksam 61,9 65,2 64,8 etwas wirksam y 97,8 101,0 100,0 unwirksam • K o n tro lle n - 1 0 0 % Die Werte stimmen insofern überein, als prinzipiell mit allen 3 Verfahren Wirksamkeit oder Unwirksamkeit der geprüften Prä­ parate erm ittelt werden können. Die makroskopische und lupen- mikroskopische Beurteilung der Lungenoberfläche gibt naturgemäß übereinstimmende Resultate, wobei der lupenmikroskopisch er­ hobene Schweregrad gleich oder höher ist. Die histopathologische Untersuchungsmethode vermag insofern mehr zu erfassen, als sie das Lungeninnere mit berücksichtigt, auch kleinste Herde auffinden läßt und außerdem ein eingehendes Studium der qualitativen Unter­ schiede der Lungenveränderungen erlaubt. Diese Gegebenheiten werden durch unsere Erfahrungen belegt, wonach bei 730 Versuchs­ gruppen (100%) die histologische Untersuchung 426mal (58%) mit der lupenmikroskopischen Bewertung übereinstimmte, in 211 Fällen (29%) strenger war als diese und nur in 95 Fällen (13%) einen ge­ ringeren Schweregrad der Veränderungen ermittelte. Schw eiz. Z. T u b c r k .. Vol. 12, No. 6. 1955 34 F u s t e t al., C h em o th erap ie d er ex p erim entellen T u b erk u lo se I 4 7 6 Histologischer Leberindex Die Auslese der Lebern für die histologische Kontrolle erfolgt, wie erwähnt, nach dem makroskopischen und lupenmikroskopischen Lungenbefund und garantiert daher die erwünschte Zufälligkeit. Bei der Untersuchung je eines Stufenschnittes fanden wir nach­ stehende Indices für den Schweregrad der tuberkulösen Leberver­ änderungen : In d ic e s f ü r G csa in tle b c r-In d c x P r ä p a r a t h e rd fö rm ig e diffuse B e u rte ilu n g Maus r e t ik u lä re re t ik u lä re a bsolut r e la tiv * H y p e rp la sie n H y p e rp la sie n ¡n % 1 + 1,2 INH 48,9 wirksam 1,2 l,l 1,6 + 1,4 = 1.5 etwas wirksam X 1,6 1,4 66,7 2,0 + 2,25 2,0 2,25 = 2,13 90.2 unwirksam * K o n tro lle n = 1 0 0 % Allgemein spricht die Lebertuberkulose der Maus weniger gut auf Antituberkulotika an als die Lungentuberkulose. Beim Meer­ schweinchen ist dieses Verhältnis gerade umgekehrt [15, 16]. Die schlechte therapeutische Beeinflußbarkeit der Mäuseleber gibt uns einen sehr strengen Maßstab für die antituberkulöse Wirksamkeit der Präparate in die Hand. Das äußert sich auch darin, daß von 730 (100%) Versuchsgruppen der Schweregrad der Lebertuberkulose in 680 Gruppen (93%) durch wirksame Präparate weniger gut zu beein­ flussen w-ar als der Schweregrad der Lungenveränderungen, gemes­ sen an der lupenmikroskopischen Beurteilung, welche bezüglich der Strenge der Wertung eine Mittelstellung zwischen makroskopischer und histologischer Untersuchung eiunimmt. Im Laufe der letzten Jahre haben wir mit der histopathologi- schen Kontrolle festgestellt, daß der lupenmikroskopische Index des Lungenbefundes eine gute Charakterisierung der antituberku­ lösen A ktivität erlaubt. Der makroskopische Index ist etwas unge­ nauer. Die Ermittlung des histologischen Leber- und Lungenindexes erfordert erheblichen Arbeitsaufwand. Die beiden letzteren Methoden F u s t ct al., C h em otherapie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 7 behalten aber ihren Wert zur Differenzierung hochwirksamer Prä­ parate. Mit Hilfe des lupenmikroskopischen Lungenindexes werden demnach Präparate wie folgt charakterisiert: 1. Kleinste Dosis, die gut wirksam ist (relativer Index < 60 = + ) . 2. Kleinste Dosis, die lupenmikroskopisch noch etwas wirksam ist (aktive M inim aldosis, relativer Index 60-80 = [ + ] ) . 3. Höchste Dosis, die unter denselben Bedingungen unwirksam ist (relativer Index > 80 = —). 4. Der Isoniazidindex. Der Isoniazidindex ergibt sich aus dem Vergleich der A ktivität der geprüften Verbindungen mit derjenigen von IN H . Er errechnet sich aus dem Quotienten: aktive Minimaldosis von INH — :------— ---------- ;------------------------ 100 aktive Minimaldosis von Präparat x Für IN H beträgt die aktive Minimaldosis 7,5 ing/kg bei oraler und 2,5 mg kg bei subkutaner Applikation. Bei wasserlöslichen Prä­ paraten kann somit ein oraler und ein subkutaner Isoniazidindex bestimmt werden. Beispiel: Die minimale wirksame orale Dosis von INH beträgt 7,5 mg/kg (lupenmikroskopische Beurteilung), diejenige der Ver­ bindung z 15 m g/kg; der Isoniazidindex per os erreicht den Wert — • 100 = 50. Subkutan ist IN H in Dosen von 2,5 mg/kg gerade noch etw'as aktiv, das Medikament z in Dosen von 7,5 mg/kg. Der Isoniazid- 2.5 index beträgt bei subkutaner Darreichung — • 100 = 33. 7.5 Z us a m m e nftr iss u ng Es wird der Untersuchungsgang zur Prüfung auf antituberku­ löse Wirkung an i.v . mit dem humanen Tuberkclbazillenstamm H 37R v infizierten Mäusen einschließlich der Ermittlung der Toxizität nach einmaliger Verabreichung der Präparate an der Maus ein­ gehend beschrieben. Zur zahlenmäßigen Bewertung der Wirkung werden die makroskopisch und lupenmikroskopisch erkennbaren tuberkulösen Veränderungen in der Lunge sowie die histopatho- logisch nachweisbaren Veränderungen in Lunge und Leber im Ver­ 4 7 8 F u s t e t al., C h em o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se 1 gleich zum Verhalten gleich infizierter, nicht behandelter Kontroll- tiere herangezogen. Mit dieser Methodik wurden zahlreiche Derivate von Isoniazid untersucht, deren A ktivität gewichtsmäßig mit jener von Isoniazid verglichen und so durch den Isoniazid-Index charakterisiert wird. Über Ergebnisse und Zusammenhänge zwischen chemischer K onsti­ tution und antituberkulöser Wirkung wird gemeinsam mit der chemischen Arbeitsgruppe in den Mitteilungen «Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose II, III und IV» berichtet werden. Résumé On décrit en détail la méthode suivie pour déterminer l’effet antituberculeux chez la souris, après inoculation intraveineuse de bacilles tuberculeux du type humain, souche H37 Rv. La toxicité des préparations employées a été déterminée auparavant par admi­ nistration d’une dose unique. Pour l’évaluation numérique de l’acti­ vité, on considère les altérations tuberculeuses dans le poumon, reconnaissables à l’œil nu et à la loupe, ainsi que les altérations histo-pathologiques dans le poumon et dans le foie, en comparant l’état des animaux traités à celui des animaux d’une série de con­ trôle, infectés de la même façon mais non traités. La méthode en question a été appliquée à de nombreux dérivés de l’isoniazide. En comparant leur activité à celle de l’isoniazidc en fonction du poids de la substance utilisée, on obtient l’indice d’isoniazide. Des rapports seront publiés dans les communications II, III et IV «Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose », en collabora­ tion avec les chimistes, sur les résultats obtenus et sur les relations entre la constitution chimique et l’effet antituberculeux. Riassunto Si descrive dettagliatam cnte il método seguito per determinare la reazione antitubcrcolare in topi inoculad per via endovenosa con bacilli tubercolari umani del ceppo II37 Rv. Si verifica la tossicitá dei preparati dopo una singóla somministrazione. Alio scopo di valutare numéricamente tale reazione, vengono prese in considera- zione le alterazioni tubercolari del polmone riconoscibili macro­ scópicamente e colla lente d’ingrandimento, nonchi* le alterazioni F u s t e t a l., C hem o th erap ie d er ex p erim en tellen T u b erk u lo se 1 4 7 9 iclentificabili istopatologicamente nel polmone e nel legato in con­ fronto ad animali da controllo egualmente inoculati, ma non sotto- porti ad aleun trattamento. Con tale método furono esaminati numerosi derivati della isonicotinil-idrazina, la cui attivitä viene comparata, in funzione del peso, a quclla dell’isonicotinil-idrazina e caratterizzata in tale maniera dall’indice isoniazidico. Sui risultati ottenuti e sulla relazione tra costituzione chimica e effetto antitubercolarc verrá riferito, con il concorso dei nostri colla- boratori chimici, nelle comunicazioni «Chemotherapie der experi­ mentellen Tuberkulose II, III und IV». Summary The authors describe in detail a method of investigating anti- tuberculotic activity in mice infected i.v . with human tubercle bacilli, strain H37R v; details given include the estimation of toxicity in the mouse following a single administration of the preparation. For quantitative evaluation of the results both the tuberculous lesions in the lungs, which are recognizable macroscopically or with the aid of a magnifying glass, and histopathologically evident alterations in the lungs and liver are used for comparison with similarly infected but untreated controls. Numerous isoniazid derivatives were tested by this means and their activity compared weight for weight with that of isoniazid and expressed in terms of an “isoniazid index” . The results and the relations between chemical structure and antitubcrculotic effect will be reported in collaboration with the chemical team in the communications on “ Chemotherapy of Experi­ mental Tuberculosis II, III and IV ” . LITERATUR 1. Grunberg, E. and H. ./. Schnitzer: Quart. Bull. Sea View Hosp. 13, 3/11, 1952. 2. [sler, O., II. Gutmann, 0. Straub, B. Fust, E. Böhni und A. Sluder: Hclv. chim. Acta 38, 1033, 1955. - 3. Id.: ib. 38, 1046, 1955. - 4. Winterstein, A., B. Hegcdiis, B. Fust, E. Böhni und A. Sluder: Hclv. chim. Acta 3 9 ,1956 (im Druck). - 5. Fust, B. und A . Studer: Helv. mcd. Acta 18, 449, 1951. - 6. Raleigh, G. W. and G. P. Youmans: J. infect. Dis. 82, 197, 205, 1948. - 7. Moeschlin, S., G. .1accord und M. Boßhard: Experientia 4, 158, 1948. - 8. Moeschlin, S., G. Jaccard, M. Boß- hard und W. Muehlon in: Streptomycin und Tuberkulose von G. Fanconi und W. Löffler. Schw'abe, Basel 1948. - 9. Rake, G., W. P. .Jambor, C. M. Mckec, F. Pansy, 4 8 0 L ibri F. Y. Wiselogle and R. Donovick: Amer. Rev. Tuberc. 60, 121, 1949. - 10. Hurni, H., R. Hirt und Ragaz: Schweiz. Z. Path. Hakt. 14, 17, 1951. 11. Fong, E.H.: .1. Bact. 27, 102, 1934. 12. Pagel, IV.: Amer. Rev. Tubcrc. 46, 295, 1942. - 13. Miller, L.C. and M .L . Tainter: Proc. Soc. exp. Bio!., N.Y. .57, 261, 1944. -- 14. Grumbach, A.: Schweiz. Z. Path. Bakt. 12, 614, 1949. 15. Fust, 11. und A . Sluder: Schweiz. Z. Path. Bakt. 14, 523, 1951. - 16. Fust, 11., A. Sluder und E. Böhni: Schweiz. Z. Tubcrk. 9, 226. 1952. Adresse der Autoren: PD Dr. B. Fust, PD Dr. A. Studcr und Dr. E. Böhni, Wissenschaftliche Laboratorien der F. Hoffmann-La Roche & Co. AG, Hasel (Schweiz). Lihri Edouard Risl: La tuberculose. 3' édit. Collection A. Colin, Paris 1954. 220 pages, 17 fig. ffrs. 500. Le petit volume que Rist a écrit au Centenaire de la mort de Laënnec était épuisé depuis 1944. Nous avons éprouvé cela comme une lacune de ne plus pouvoir recommander cet ouvrage. Aussi, nous saluons cette 3e édition, entièrement refon­ due, avec satisfaction. Cet ouvrage est destiné en premier lieu à un public cultivé, non médecin, désireux de connaître la tubercidose. cette maladie qui joue un si grand rôle dans la vie de l’humanité. Présenter ce sujet dans son ensemble, sous une forme condensée, d’une façon à la fois didactique et critique, sans être trop sommaire et trop simpliste, sous un volume restreint, est un tour de force que Rist a su magistralement accom­ plir. Il fallait l’esprit clair et absolument objectif d’un homme de l’autorité de Rist dans la matière, pour écrire une étude dont on puisse recommander la lecture sans arrière-pensée. Tel qu’il est, il est souhaitable que ce volume soit largement répandu, non seulement dans le public non médecin, mais parmi les médecins non spécialisés en tuberculose et parmi toutes les personnes qui ont à s’occuper de tuberculeux, médicalement ou socialement. Même pour le médecin spécialisé dans la matière, il représente sous une forme condensée l’essentiel de ce qu’il faut savoir sur l’cn- scinble de la maladie tuberculeuse. Rist traite successivement : de l’histoire de nos connaissances sur la tuber­ culose; des caractéristiques morphologiques et biologiques du bacille de Koch: des problèmes de l’infection, de l’allergie et de l’immunité dans cette maladie; des éléments de son diagnostic; des différentes méthodes de traitem ent; enfin des pro­ blèmes sociaux qu’elle comporte (prophylaxie; dépistage; lutte antituberculeuse et assistance sociale). L’évolution rapide de tous ces domaines au cours des dernières années a obligé Rist à un remaniement total de son ouvrage. Relevons comme particulière­ ment heureux le fait que Rist, dont l’expérience est particulièrement longue, insiste et met l’accent sur l'importance de la cure méthodique de repos, si possible en milieu sanatorial, comme hase de toute thérapeutique efficace des diverses manifes­ tations de la tuberculose. Il met en garde le publie, en général, et la jeune génération http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png Respiration Karger

Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose I

Fust, B.; Studer, A.; Böhni, E.
Respiration , Volume 12 (6): 13 – Jan 1, 1955
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Publisher
Karger
Copyright
© 1955 S. Karger AG, Basel
ISSN
0025-7931
eISSN
1423-0356
DOI
10.1159/000191680
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Abstract

Fuat, l i ., A . Studer u n d E . B ö h n i: Schwei/.. Z. T u b e rk . 12y 4 6 9 -4 8 0 , 1955 Aus den Wissenschaftlichen Laboratorien der F. Hoffmann-La Koche & Co. AG, Basel Bewertung der antituberkulösen Wirkung im Mäuseversuch Von B. FUST, A. STUDER und E. BÖHNI 1. Einleitung Grimberg und Schnitzer [1] haben als erste gezeigt, daß dem Isonicotinsäurehydrazid und vielen seiner Derivate eine beträcht­ liche antituberkulöse A ktivität zukommt. Im Anschluß an diese Befunde stellte sich unserer Arbeitsgruppe das Problem, die Wir­ kung des Isoniazids eingehender zu analysieren, aus einer größeren Zahl von aktiven Isoniazidderivaten die Präparate mit optimaler Wirkung auszusuchen und durch das Studium der Beziehungen zwischen K onstitution und A ktivität in dieser Reihe dem Chemiker Hinweise für weitere Synthesen zu geben [2-41- In der vorliegenden Arbeit wird die angewendete biologische Methodik beschrieben. In der Überzeugung, daß Reagensglasversuche keine sicheren Anhaltspunkte für die klinische Brauchbarkeit einer Substanz als Antituberculoticum liefern können, wandten wir uns von Anfang an dem Tierexperiment zu. Grundsätzlich hielten wir uns an die von Fust und Studer [5] beschriebene Methode, die wir im Laufe der Zeit weiter ausbauten und teilweise speziell für die Beurteilung von Abkömmlingen des INH Zuschnitten. Wie andere Prüfer [6-10] wählten wir die weiße Maus als Versuchstier, obschon die künstlich an ihr erzeugbare Tuberkulose in verschiedener Hinsicht, besonders histopatholo- gisch, stark von der Tuberkulose des Menschen, vor allem aber auch derjenigen anderer Tiere abweicht [11, 12]. Die kurze Generations­ dauer, die gute Reproduktionsfähigkeit, die Möglichkeit der Inzucht F u s t et al., C hem o th erap ie d er ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 6 9 mäßigen Grades ohne Gefahr rasch eintretender Degeneration und die relativ bescheidenen Ansprüche in bezug auf Raumbedarf und Wartung bieten Vorteile, welche diese Spezies für die Durchführung großer Reihenversuche besonders geeignet erscheinen lassen. Aus­ schlaggebend aber ist die Tatsache, daß die Tuberkulostatika, die sich am Patienten bewährt haben, in der Regel ihre A ktivität, ob­ schon in wechselndem Maße, auch an der Maus bekunden. Wir kennen bis jetz t nur wenige Stoffe, die im Mäuseexperiment ver­ sagen und am klassischen Versuchstier für die Tuberkulose, am Meerschweinchen, wirksam sind. Zweifellos ist das Meerschweinchen mit seiner Einkeimdisposition für die Tuberkulose das feinere Instrument zum Nachweis antituberkulöser Effekte als die Maus, die nur auf die Infektion mit massiven Dosen von Tuberkelbazillen zu erkranken pflegt. Praktisch ist aber die Gefahr wohl gering, daß ein hoch-wirksamer tuberkulostatischer oder tuberkulozider Stoff' im Mäuseversuch übersehen werden könnte. Für das Studium der Im m unitäts- und Allergieverhältnisse bei der Tuberkulose und anderer Vorgänge, welche die Disposition oder Resistenz des Wirts­ organismus beeinflussen, dürfte dagegen die Maus weniger geeignet sein. Das Mäuseexperiment nimmt daher eine gewisse Mittelstellung zwischen dem Reagensglastest und dem Versuch am Meerschwein­ chen ein, besonders wenn das am m eisten geübte Simultanverfahren benützt wird. Gegenüber den Reagensglastesten hat das Tierexperiment den Vorteil, daß man sich von vorneherein mit der Verträglichkeit bzw. der T oxizität der zu prüfenden Präparate vertraut machen muß. Viele Stoffe, die in vitro aktiv sind, erweisen sich als toxisch, andere büßen in vivo die Wirksamkeit ein. 2. Prüfung a u f Verträglichkeit Wir bestimmen die Toxizität, indem wir Mäusen einmal abge­ stufte Dosen der zu prüfenden Verbindungen als wässerige Lösun­ gen subkutan injizieren oder als Suspension in Gummi arabicum miL der Magensonde verabreichen. Nachdem wir in Vorversuchen den Toxizitätsbereich einer Ver­ bindung einigermaßen abgetastet haben, führen wir mit einer größeren Zahl von Tieren den Hauptversuch aus. Bei der Abstufung der Dosen und der Besetzung der einzelnen Positionen tragen wir den Eigenschaften der Präparate so weit als möglich Rechnung. F u s t e t al., C h em o th erap ie d er ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 0 Präparate, deren tödliche Dosis nahe bei der symptom los verträg­ lichen Dosis liegt, erfordern keinen so großen Einsatz wie Verbin­ dungen, deren Toxizitätsw erte stark streuen. Wir beobachten die Tiere 6 -8 Tage und berechnen dann die Dosis letalis 50% (DL 50) nach unserem eigenen Verfahren in der Weise, daß wir alle Dosen zwischen der Dosis letalis 0-10% (DL 10) und der Dosis letalis 90-100 % (DL 90) benützen. (d, + (L) v2 + (da + d3) (v3 — v,) (d:1 + (1,) (v, — v3) Beispiel DL 50 Präparat Dosis letalis Dosen Verhältnis der gestorbenen 0/ /o zu den eingesetzten Mäusen mg/kg (<9 (V ) d4 = 2250 6 / 6 v4 = 100,0 d3 = 2000 5 / r> v , = 83,4 ds = 1500 2 / 6 V, = 33,3 d ! = 1250 0 / 4 v1 = 0 (1250+1500)-33,3 +-(1500+2000) • (83,4 — 33,3)+(2000 r 2250)-(100 — 83,4) Diese Methode hat den Vorteil, daß man mit beliebigen Zwi­ schendosen und Tierzahlen arbeiten kann; ausnahmsweise haben wir in der allerjüngsten Zeit die DL 90, 50 und 10 am 1. und 10.Tage nach Versuchsbeginn mit der Probit-Methode ermittelt [13]. 3 3. Prüfung a u f antituberkulöse Wirkung a) Dosierung und Applikation der Präparate Für die Tuberkuloseversuche verwenden wir zuerst Tagesdosen von V<_1/s der symptomfrei verträglichen DL 10. Verbindungen, die in dieser Dosierung noch hochwirksam sind, werden anschließend in absteigenden Dosen zur Festlegung des Isoniazidindex (vgl. S. 477) geprüft. Nach unseren Erfahrungen werden Dosen von Vj - '/ j der symptomfrei verträglichen DL 10 nur selten auf die Dauer nicht gut vertragen; sie stellen aber in der Regel die höchstmöglichen Gaben dar, insbesondere wenn die Präparate mit der Magensonde oder subkutan appliziert werden. Dem Futter beigemischt sind bisweilen auch noch wesentlich größere Mengen verträg­ lich. Wir haben die zu prüfenden Verbindungen stets in Futterbiskuits cingcbackcn und wasserlösliche Substanzen zusätzlich noch auf ilire Wirkung hei subkutaner Zufuhr geprüft. Die Verabreichung im Futter sichert automatisch eine ziemlich regelmäßige Aufnahme des Medikaments und vermeidet große Schwankungen des F u s t e t al., C hem o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erkulose 4 7 1 Blut- und Gewebegehaltes, während eine subkutane Injektion pro Tag eher eine rasch abfallende Spitzenkonzentration im Organismus bewirkt. b) Impfmaterial und Infektionsmodus Zur Infektion verwenden wir den global bekannten humanen Tuberkclbazil- lenstamm H3-Rv, den wir 9-11-13 Tage in Original-Dubos-Nährflüssigkeit mit Twecn züchten. Die Kulturen werden unter Zusatz frischer Dubos-Nälirllüssigkeit so lange verdünnt, bis die nephelometrisch gemessene Durchlässigkeit der Suspen­ sion 70% derjenigen der unbeimpften Dubos-Nährflüssigkcit erreicht. Davon spritzen war weißen Inzuchtmäusen, den Nachkommen von Vettern und Basen aus der eigenen Zucht, je 0,5 ein3 intravenös ein. Für die Gewinnung reproduzierbarer Resultate halten wir die Verwendung erbbiologisch einigermaßen einheitlicher Tiere für unerläßlich, weil Mäuse verschiedener Provenienz im allgemeinen auch bezüglich ihrer Tuberkulosedisposition stark differieren [14]. Unsere Mäuse sind in mittlerem Grade ziemlich gleichmäßig für massive Infektionen mit Tuberkel­ bazillen empfänglich. Um allfällig dennoch vorkommende individuelle Schwan­ kungen auszugleichen, setzen wir für jede Dosis eines jeden Präparates 10 Tiere ein. c ) Behandlungsdauer Die Behandlung beginnt am Tage nach der Infektion (Simultancxpcriment). Die Tiere erhalten die zu prüfenden Präparate bis zum Versuchsabschluß. Am 19. Tage töten wir die Mäuse, um den Obduktionsbefund zu erheben und Material für die histologische Untersuchung zu gewinnen. d) Pathologie der experimentellen Tuberkulose der Maus und Bewertung der a u f anti­ tuberkulöse Aktivität untersuchten Substanzen. Nach der intravenösen Injektion von Tuberkelbazillen treten bei der Maus regelmäßig spezifische Veränderungen in der Lunge und in der Leber auf; Milz, Herz und Nieren sind weniger häufig und oft auch in nicht so charakteristischer Art befallen. Die Veränderungen sind zum größten Teil schon von bloßem Auge, besser noch bei 6- bis lfifacher Vergrößerung mit dem Lupenmikroskop oder bei der histologischen Untersuchung erkennbar. Wir erheben daher makroskopische, lupen­ mikroskopische und histologische Befunde. Makroskopisch und lupenmikroskopisch untersuchen wir stets Lunge, Herz, Milz und Leber aller, histologisch nur Lunge und Leber der Hälfte der Versuchs­ und Kontrolltiere. In der Lunge nicht oder erfolglos behandelter Mäuse bilden sich mehr oder minder zahlreiche graue oder gelbliche, leicht eingesunkene, flache oder promi­ nente Herde oder Knötchen verschiedener Größe und Konsistenz, die gelegentlich konfluieren. Seltener kommen ausgedehnte spezifische Herdpneumonien vor. Der Herzmuskel ist hie und da in wechselndem Grade von graublauen Herden oder gelblichen Knötchen verschiedenen Durchmessers durchsetzt. Die Milz reagiert auf die tuberkulöse Infektion meist mit einer allgemeinen Volumen- und Gewichtszunahme, die sehr stark ausgeprägt sein kann. Distinkte weiße oder gelbliche, runde oder in Streifen angeordnete, eingesunkene, flache oder prominente Herde werden nicht so häufig beobachtet. 4 7 2 F u s t e t al., C h em o th erap ie d er experim entellen T u b erk u lo se I Auch die Leber ist nicht selten vergrößert. Manchmal tr itt die Läppchen­ zeichnung stärker hervor. Herdförmige Veränderungen, die von bloßem Auge oder mit dem Lupenmikroskop erfaßbar sind, pflegen nicht konstant vorzukom­ men. Es handelt sich um weiße oder gelbe Knötchen unterschiedlicher Größe und Konsistenz, um unregelmäßig begrenzte, flache gelb- oder braungrüne oder um graurotc, meist punktförmige Herde. Im histologischen Schnitt finden wir hin­ gegen recht regelmäßig spezifische Veränderungen. Die geschilderte Art der Untersuchung verm ittelt uns einen weitgehend vollständigen Gesamteindruck über den Schweregrad der tuberkulösen Erkrankung der Mäuse. Die Wirkung der untersuchten Verbindungen zeigt sich in einer Reduktion oder im Ausbleiben der beschriebenen Veränderungen. Zur zahlenmäßigen Erfassung der Verhältnisse ziehen wir die makroskopisch, lupenmikroskopisch und histologisch nachweisbaren spezifischen Lungenveränderungen, sowie die histologisch erkennbaren tuberkulösen Veränderungen in der Leber heran. Bei der Beurteilung mit unbewaffnetem Auge und bei der Unter­ suchung unter dem Lupenmikroskop unterscheiden wir 4 Schwere­ grade der tuberkulösen Erkrankung der Mäuselunge, wobei wir vor­ wiegend der Zahl, so weit als möglich aber auch der Ausdehnung und der Qualität der Veränderungen Rechnung tragen. 1-2 kleine oder mittelgroße Herde werden mit +, einige Herde mit + + , reich­ lich Herde mit +++ und massenhaft Herde mit ++++ registriert. Wir fassen die Gesamtheit der spezifischen Luugenveränderungen einer Tierserie in einem Gruppenindex zusammen, der den mittleren Schweregrad der tuberkulösen Lungenerkrankung zum Ausdruck bringt. Der absolute Gruppenindex wird errechnet, indem wir die Prozentzahlen der obduzierten Mäuse mit + + _r + mit dem Faktor 4, jene der Mäuse mit +++ mit dem Faktor 3 und jene der Mäuse mit ++ mit dem Faktor 2 multiplizieren. Zu den 3 Produkten addieren wir die einfache Prozentzahl der Mäuse mit + . Wird der Gruppen­ index der Kontrolltiere gleich 100 gesetzt und mit dem Gruppen­ index der behandelten Mäuse verglichen, so können wir den rela­ tiven mittleren Schweregrad (relativer Index) der spezifischen Lungen­ erkrankung bestimmen. Bei jedem Versuch führen wr ir I N H als Standardpräparat in Tagesdosen von 20 mg/kg mit. Der aktuelle Gruppenindex für Isoniazid erlaubt uns jeweilen den direkten Ver­ gleich der untersuchten Verbindungen mit IN H . Zwischen dem makroskopisch festgestellten und dem lupenmikroskopisch ermittel­ ten Gruppenindex besteht naturgemäß nur ein gradueller Unter­ F u s t e t al., C h em otherapie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 3 schied; die Untersuchung m it der Lupe deckt bisweilen noch winzige spezifische Veränderungen auf, die dem unbewaffneten Auge ent­ gehen. Mit beiden Verfahren erfassen wir jedoch nur die Herde an der Lungenoberfläche. Wir halten, wenigstens für Präparate, die eine gewisse A ktivität zeigen, für eine eingehende Beurteilung die histopathologische Untersuchung als notwendig. Bei dieser finden wir Knötchen und spezifische Herdpneumo­ nien. Die Knötchen entstehen durch herdförmige Proliferationen der Alveolarepithelien und setzen sich aus ziemlich großen, hellen Zellen mit schaumigem Protoplasma zusammen. Wir bezeichnen sie als «Epitheloidzellknötchcn». Es handelt sich aber nicht um Epi- theloidzellen im klassischen Sinne, da sie im Gegensatz zu diesen gelegentlich Tuberkelbazillen enthalten. In solchen Knötcheu finden wir außerdem Makrophagen, welche dem Interstitium des verdickten Alveolarsystems entstammen. In den spezifisch pneu­ monischen Bezirken tritt die alveoläre Proliferation ganz zurück. Die Alveolarepithelien desquamieren rasch. Das Alveolargerüst bleibt aber noch lange erhalten. Solche Herde sind stark leukocytär infiltriert und enthalten im Vergleich zu den Knötchen massenhaft Tuberkelbazillen. In ihrer Umgebung liegen nicht selten basophile, homogene, schollige Massen noch unklaren Ursprungs. Nach der Zahl und Ausdehnung der Veränderungen im histologischen Schnitt unterscheiden wir drei Schweregrade 1-3. Der histologische Gesamt­ lungenindex einer Gruppe wird als Durchschnitt der untersuchten 4 -6 Lungen errechnet und stellt die Summe des mittleren Schwere­ grades der tuberkulösen Veränderungen in 1— 3 Paraffinstufen­ schnitten dar. Hierbei werden die proliferativen Knötchen («Epi- thcloidzellknötchen») und die spezifischen Herdpneumonien mit den lndices 1-3 bewertet, wobei der Index für die Herdpneumonien en t­ sprechend ihren tiefgreifenderen geweblichen Veränderungen ver­ doppelt wird. Die Leber tuberkulöser Mäuse zeigt herdförmige Hyperplasien des retikuloendothelialen Systems mit Bildung zahlreicher, diffus über das Gewebe verteilter Knötchen, außerdem eine diffuse Hyper­ plasie der Kupfferschen Sternzellen. Nekrotische Einschmelzung ist hier so selten, daß sie vernachlässigt werden darf. Wir unter­ suchen 1 Paraffinschnitt aus jeder Leber, ermitteln den Schweregrad 1-3 für die herdförmige und getrennt für die diffuse retikuloendo- theliale Hyperplasie und berechnen den Gesamtleberindex einer Gruppe als Mittel der genannten lndices. 4 7 4 F u s t e t al., C h em o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I Die histologisch ge­ wonnenen Zahlen werden wiederum mit den entspre­ chenden Werten bei nicht behandelten und bei mit INH behandelten Mäusen in Beziehung gebracht. An einem Beispiel soll die Ermittlung der ver­ gleichbaren Zahlen erläu­ tert werden. Wir untersu­ chen das Verhalten einer Gruppe von 20 unbehandel­ ten K ontrollieren mit 3 Gruppen von je 10 Ver­ suchsmäusen, von denen je eine 20 mg Isoniazid, 50 mg von Präparat x oder 100 mg von Präparat y pro kg und Tag per os erhalten hat. Histologischer Lungenindex Da wir nur die Lungen und Lebern der Hälfte der Mäuse histologisch zu untersuchen pflegen, ist es wichtig, eine repräsentative Auswahl zu treffen. Diese wird nach dem makrosko­ pischen und lupenmikro­ skopischen Lungenbefund vorgenommen. Die histologische Be­ wertung ergibt folgende Schweregrade der tuberku­ lösen Lungenerkrankung: Makroskopischer Liingeniivlcx F u s t e t al., C hem o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 5 IndiccA für G e sa m tlu n g e n in d c x P r ü p n r a t B e u rte ilu n g «E pitheloid* spezielle Herd* re la tiv * a b s o lu t zellk n ö tch cn » p u e u tn o n ien Maus INH Durchschnitt 0,6 0,13 0,6 + 2 X 0,13 = 0,86 19,1 wirksam von 5 Tieren Maus X Durchschnitt 1,6 0,66 1,6 + 2 x 0,66 = 2,92 64,8 etwas von 5 Tieren wirksam Maus Durchschnitt 2,5 1 2,5 + 2 x 1 = 4 , 5 100 unwirksam von 5 Tieren * K o n tro lle n 1 0 0 % Der t bersicht halber stellen wir die auf verschiedene Weise gewonnenen relativen Lungenindices zusammen: R e la tiv e L un g e n in d ic es in % • P r ä p a r a t B e u rte ilu n g m a k ro sk o p isc h lu p e n m ik ro sk o p isc h h isto lo g isc h INH 22,8 32,6 19,1 wirksam 61,9 65,2 64,8 etwas wirksam y 97,8 101,0 100,0 unwirksam • K o n tro lle n - 1 0 0 % Die Werte stimmen insofern überein, als prinzipiell mit allen 3 Verfahren Wirksamkeit oder Unwirksamkeit der geprüften Prä­ parate erm ittelt werden können. Die makroskopische und lupen- mikroskopische Beurteilung der Lungenoberfläche gibt naturgemäß übereinstimmende Resultate, wobei der lupenmikroskopisch er­ hobene Schweregrad gleich oder höher ist. Die histopathologische Untersuchungsmethode vermag insofern mehr zu erfassen, als sie das Lungeninnere mit berücksichtigt, auch kleinste Herde auffinden läßt und außerdem ein eingehendes Studium der qualitativen Unter­ schiede der Lungenveränderungen erlaubt. Diese Gegebenheiten werden durch unsere Erfahrungen belegt, wonach bei 730 Versuchs­ gruppen (100%) die histologische Untersuchung 426mal (58%) mit der lupenmikroskopischen Bewertung übereinstimmte, in 211 Fällen (29%) strenger war als diese und nur in 95 Fällen (13%) einen ge­ ringeren Schweregrad der Veränderungen ermittelte. Schw eiz. Z. T u b c r k .. Vol. 12, No. 6. 1955 34 F u s t e t al., C h em o th erap ie d er ex p erim entellen T u b erk u lo se I 4 7 6 Histologischer Leberindex Die Auslese der Lebern für die histologische Kontrolle erfolgt, wie erwähnt, nach dem makroskopischen und lupenmikroskopischen Lungenbefund und garantiert daher die erwünschte Zufälligkeit. Bei der Untersuchung je eines Stufenschnittes fanden wir nach­ stehende Indices für den Schweregrad der tuberkulösen Leberver­ änderungen : In d ic e s f ü r G csa in tle b c r-In d c x P r ä p a r a t h e rd fö rm ig e diffuse B e u rte ilu n g Maus r e t ik u lä re re t ik u lä re a bsolut r e la tiv * H y p e rp la sie n H y p e rp la sie n ¡n % 1 + 1,2 INH 48,9 wirksam 1,2 l,l 1,6 + 1,4 = 1.5 etwas wirksam X 1,6 1,4 66,7 2,0 + 2,25 2,0 2,25 = 2,13 90.2 unwirksam * K o n tro lle n = 1 0 0 % Allgemein spricht die Lebertuberkulose der Maus weniger gut auf Antituberkulotika an als die Lungentuberkulose. Beim Meer­ schweinchen ist dieses Verhältnis gerade umgekehrt [15, 16]. Die schlechte therapeutische Beeinflußbarkeit der Mäuseleber gibt uns einen sehr strengen Maßstab für die antituberkulöse Wirksamkeit der Präparate in die Hand. Das äußert sich auch darin, daß von 730 (100%) Versuchsgruppen der Schweregrad der Lebertuberkulose in 680 Gruppen (93%) durch wirksame Präparate weniger gut zu beein­ flussen w-ar als der Schweregrad der Lungenveränderungen, gemes­ sen an der lupenmikroskopischen Beurteilung, welche bezüglich der Strenge der Wertung eine Mittelstellung zwischen makroskopischer und histologischer Untersuchung eiunimmt. Im Laufe der letzten Jahre haben wir mit der histopathologi- schen Kontrolle festgestellt, daß der lupenmikroskopische Index des Lungenbefundes eine gute Charakterisierung der antituberku­ lösen A ktivität erlaubt. Der makroskopische Index ist etwas unge­ nauer. Die Ermittlung des histologischen Leber- und Lungenindexes erfordert erheblichen Arbeitsaufwand. Die beiden letzteren Methoden F u s t ct al., C h em otherapie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se I 4 7 7 behalten aber ihren Wert zur Differenzierung hochwirksamer Prä­ parate. Mit Hilfe des lupenmikroskopischen Lungenindexes werden demnach Präparate wie folgt charakterisiert: 1. Kleinste Dosis, die gut wirksam ist (relativer Index < 60 = + ) . 2. Kleinste Dosis, die lupenmikroskopisch noch etwas wirksam ist (aktive M inim aldosis, relativer Index 60-80 = [ + ] ) . 3. Höchste Dosis, die unter denselben Bedingungen unwirksam ist (relativer Index > 80 = —). 4. Der Isoniazidindex. Der Isoniazidindex ergibt sich aus dem Vergleich der A ktivität der geprüften Verbindungen mit derjenigen von IN H . Er errechnet sich aus dem Quotienten: aktive Minimaldosis von INH — :------— ---------- ;------------------------ 100 aktive Minimaldosis von Präparat x Für IN H beträgt die aktive Minimaldosis 7,5 ing/kg bei oraler und 2,5 mg kg bei subkutaner Applikation. Bei wasserlöslichen Prä­ paraten kann somit ein oraler und ein subkutaner Isoniazidindex bestimmt werden. Beispiel: Die minimale wirksame orale Dosis von INH beträgt 7,5 mg/kg (lupenmikroskopische Beurteilung), diejenige der Ver­ bindung z 15 m g/kg; der Isoniazidindex per os erreicht den Wert — • 100 = 50. Subkutan ist IN H in Dosen von 2,5 mg/kg gerade noch etw'as aktiv, das Medikament z in Dosen von 7,5 mg/kg. Der Isoniazid- 2.5 index beträgt bei subkutaner Darreichung — • 100 = 33. 7.5 Z us a m m e nftr iss u ng Es wird der Untersuchungsgang zur Prüfung auf antituberku­ löse Wirkung an i.v . mit dem humanen Tuberkclbazillenstamm H 37R v infizierten Mäusen einschließlich der Ermittlung der Toxizität nach einmaliger Verabreichung der Präparate an der Maus ein­ gehend beschrieben. Zur zahlenmäßigen Bewertung der Wirkung werden die makroskopisch und lupenmikroskopisch erkennbaren tuberkulösen Veränderungen in der Lunge sowie die histopatho- logisch nachweisbaren Veränderungen in Lunge und Leber im Ver­ 4 7 8 F u s t e t al., C h em o th erap ie d e r ex p erim en tellen T u b erk u lo se 1 gleich zum Verhalten gleich infizierter, nicht behandelter Kontroll- tiere herangezogen. Mit dieser Methodik wurden zahlreiche Derivate von Isoniazid untersucht, deren A ktivität gewichtsmäßig mit jener von Isoniazid verglichen und so durch den Isoniazid-Index charakterisiert wird. Über Ergebnisse und Zusammenhänge zwischen chemischer K onsti­ tution und antituberkulöser Wirkung wird gemeinsam mit der chemischen Arbeitsgruppe in den Mitteilungen «Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose II, III und IV» berichtet werden. Résumé On décrit en détail la méthode suivie pour déterminer l’effet antituberculeux chez la souris, après inoculation intraveineuse de bacilles tuberculeux du type humain, souche H37 Rv. La toxicité des préparations employées a été déterminée auparavant par admi­ nistration d’une dose unique. Pour l’évaluation numérique de l’acti­ vité, on considère les altérations tuberculeuses dans le poumon, reconnaissables à l’œil nu et à la loupe, ainsi que les altérations histo-pathologiques dans le poumon et dans le foie, en comparant l’état des animaux traités à celui des animaux d’une série de con­ trôle, infectés de la même façon mais non traités. La méthode en question a été appliquée à de nombreux dérivés de l’isoniazide. En comparant leur activité à celle de l’isoniazidc en fonction du poids de la substance utilisée, on obtient l’indice d’isoniazide. Des rapports seront publiés dans les communications II, III et IV «Chemotherapie der experimentellen Tuberkulose », en collabora­ tion avec les chimistes, sur les résultats obtenus et sur les relations entre la constitution chimique et l’effet antituberculeux. Riassunto Si descrive dettagliatam cnte il método seguito per determinare la reazione antitubcrcolare in topi inoculad per via endovenosa con bacilli tubercolari umani del ceppo II37 Rv. Si verifica la tossicitá dei preparati dopo una singóla somministrazione. Alio scopo di valutare numéricamente tale reazione, vengono prese in considera- zione le alterazioni tubercolari del polmone riconoscibili macro­ scópicamente e colla lente d’ingrandimento, nonchi* le alterazioni F u s t e t a l., C hem o th erap ie d er ex p erim en tellen T u b erk u lo se 1 4 7 9 iclentificabili istopatologicamente nel polmone e nel legato in con­ fronto ad animali da controllo egualmente inoculati, ma non sotto- porti ad aleun trattamento. Con tale método furono esaminati numerosi derivati della isonicotinil-idrazina, la cui attivitä viene comparata, in funzione del peso, a quclla dell’isonicotinil-idrazina e caratterizzata in tale maniera dall’indice isoniazidico. Sui risultati ottenuti e sulla relazione tra costituzione chimica e effetto antitubercolarc verrá riferito, con il concorso dei nostri colla- boratori chimici, nelle comunicazioni «Chemotherapie der experi­ mentellen Tuberkulose II, III und IV». Summary The authors describe in detail a method of investigating anti- tuberculotic activity in mice infected i.v . with human tubercle bacilli, strain H37R v; details given include the estimation of toxicity in the mouse following a single administration of the preparation. For quantitative evaluation of the results both the tuberculous lesions in the lungs, which are recognizable macroscopically or with the aid of a magnifying glass, and histopathologically evident alterations in the lungs and liver are used for comparison with similarly infected but untreated controls. Numerous isoniazid derivatives were tested by this means and their activity compared weight for weight with that of isoniazid and expressed in terms of an “isoniazid index” . The results and the relations between chemical structure and antitubcrculotic effect will be reported in collaboration with the chemical team in the communications on “ Chemotherapy of Experi­ mental Tuberculosis II, III and IV ” . LITERATUR 1. Grunberg, E. and H. ./. Schnitzer: Quart. Bull. Sea View Hosp. 13, 3/11, 1952. 2. [sler, O., II. Gutmann, 0. Straub, B. Fust, E. Böhni und A. Sluder: Hclv. chim. Acta 38, 1033, 1955. - 3. Id.: ib. 38, 1046, 1955. - 4. Winterstein, A., B. Hegcdiis, B. Fust, E. Böhni und A. 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Adresse der Autoren: PD Dr. B. Fust, PD Dr. A. Studcr und Dr. E. Böhni, Wissenschaftliche Laboratorien der F. Hoffmann-La Roche & Co. AG, Hasel (Schweiz). Lihri Edouard Risl: La tuberculose. 3' édit. Collection A. Colin, Paris 1954. 220 pages, 17 fig. ffrs. 500. Le petit volume que Rist a écrit au Centenaire de la mort de Laënnec était épuisé depuis 1944. Nous avons éprouvé cela comme une lacune de ne plus pouvoir recommander cet ouvrage. Aussi, nous saluons cette 3e édition, entièrement refon­ due, avec satisfaction. Cet ouvrage est destiné en premier lieu à un public cultivé, non médecin, désireux de connaître la tubercidose. cette maladie qui joue un si grand rôle dans la vie de l’humanité. Présenter ce sujet dans son ensemble, sous une forme condensée, d’une façon à la fois didactique et critique, sans être trop sommaire et trop simpliste, sous un volume restreint, est un tour de force que Rist a su magistralement accom­ plir. Il fallait l’esprit clair et absolument objectif d’un homme de l’autorité de Rist dans la matière, pour écrire une étude dont on puisse recommander la lecture sans arrière-pensée. Tel qu’il est, il est souhaitable que ce volume soit largement répandu, non seulement dans le public non médecin, mais parmi les médecins non spécialisés en tuberculose et parmi toutes les personnes qui ont à s’occuper de tuberculeux, médicalement ou socialement. Même pour le médecin spécialisé dans la matière, il représente sous une forme condensée l’essentiel de ce qu’il faut savoir sur l’cn- scinble de la maladie tuberculeuse. Rist traite successivement : de l’histoire de nos connaissances sur la tuber­ culose; des caractéristiques morphologiques et biologiques du bacille de Koch: des problèmes de l’infection, de l’allergie et de l’immunité dans cette maladie; des éléments de son diagnostic; des différentes méthodes de traitem ent; enfin des pro­ blèmes sociaux qu’elle comporte (prophylaxie; dépistage; lutte antituberculeuse et assistance sociale). L’évolution rapide de tous ces domaines au cours des dernières années a obligé Rist à un remaniement total de son ouvrage. Relevons comme particulière­ ment heureux le fait que Rist, dont l’expérience est particulièrement longue, insiste et met l’accent sur l'importance de la cure méthodique de repos, si possible en milieu sanatorial, comme hase de toute thérapeutique efficace des diverses manifes­ tations de la tuberculose. Il met en garde le publie, en général, et la jeune génération

Journal

Respiration – Karger

Published: Jan 1, 1955

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